Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Ringraziamo Marie-Christine Caron per l'eccellente consulenza tecnica. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. detiene una cattedra di ricerca canadese di livello 1 in riparazione del DNA e terapie del cancro. J.O'S è uno studente di dottorato FRQS e S.Y.M è un borsista post-dottorato FRQS.

1. Coltura cellulare, trattamenti e preparazione del coverslip
NOTA: Tutte le placcature cellulari, le trasfezioni e i trattamenti, a parte l'irradiazione, dovrebbero avvenire sotto una cappa sterile di coltura cellulare.
<ol><li>Giorno 1<ol>
<li>In una piastra a 6 pozzetti, posizionare un singolo coperchio in ciascun pozzetto per tutte le condizioni necessarie. Piastra ~ 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico, come desiderato. NOTA: In caso di trasfezione,...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Questo documento descrive un metodo che utilizza la colorazione IF per misurare le variazioni nella resezione del DNA nel cellulo. Lo standard attuale per osservare un effetto sulla resezione del DNA è attraverso la colorazione RPA; tuttavia, questo è un metodo indiretto che può essere influenzato dalla replicazione del DNA. In precedenza, è stata descritta un'altra tecnica IF di resezione del DNA basata sull'incorporazione di BrdU per classificare le intensità risultanti nelle cellule BrdU-positive e BrdU-...

La modulazione dei fattori di riparazione del DNA è un metodo in continua evoluzione per la terapia del cancro, in particolare negli ambienti tumorali carenti di riparazione del DNA DSB. L'inibizione di specifici fattori di riparazione è una delle strategie ingegnose utilizzate per sensibilizzare le cellule tumorali agli agenti dannosi per il DNA. Decenni di ricerca hanno portato all'identificazione di varie mutazioni dei geni di riparazione del DNA come biomarcatori per le scelte di strategia terapeutica1. Di conseguenza, il campo della riparazione del DNA è diventato un hub per lo sviluppo di farmaci per garantire una vasta gamma di trattamenti, potenziando il concetto di medicina personalizzata. 
I DSB vengono riparati da due percorsi principali: NHEJ e HR2. La via NHEJ è soggetta a errori, legando rapidamente le due estremità del DNA con poca o nessuna elaborazione finale del DNA e coinvolgendo la proteina chinasi (DNA-PKcs), il complesso Ku70/80, le proteine 53BP1 e RIF13. Al contrario, HR è un meccanismo fedele avviato da BRCA14. Un passo essenziale nella riparazione delle risorse umane è il processo di resezione dell'estremità del DNA, che è la degradazione delle estremità rotte che porta al DNA a singolo filamento (ss) con estremità 3'-OH. BRCA1 facilita il reclutamento delle proteine a valle che formano il resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, che sono coinvolte nella resezione del DNA da 5' a 3'5. 
La resezione finale iniziale viene effettuata attraverso l'attività endonucleasi di MRE11, consentendo un'ulteriore elaborazione da parte delle nucleasi DNA2 ed EXO1. Gli sbalzi di ssDNA generati vengono rapidamente rivestiti dalla proteina di replicazione A (RPA) per proteggerli da ulteriori elaborazioni. Successivamente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 si impegnano a mediare lo spostamento di RPA e l'assemblaggio del nucleofilamento RAD51 necessario per il meccanismo di riparazione diretto all'omologia. Un buon equilibrio tra l'uso di NHEJ e HR è necessario per il mantenimento ottimale dell'integrità genomica. La scelta del percorso dipende dalla fase del ciclo cellulare. L'HR viene utilizzato preferenzialmente durante le fasi da S a G2 in cui la resezione del DNA è al più alto livello e i cromatidi fratelli sono disponibili per garantire una corretta riparazione.
La poli (ADP-ribosio) polimerasi 1 (PARP-1) è una delle prime proteine reclutate nel DSB. Regola sia l'attività di resezione che l'assemblaggio di effettori a valle coinvolti nel NHEJ5,6. PARP-1 è anche necessario per la riparazione della rottura a singolo filamento del DNA durante la replicazione7,8. A causa del suo importante ruolo nella riparazione del DNA, gli inibitori PARP (PARPi) sono usati come terapie contro il cancro. In diversi tumori con deficit di HR, il trattamento con PARPi porta a una risposta letale sintetica a causa dell'incapacità delle cellule carenti di HR di riparare il danno accumulato attraverso un percorso alternativo9,10. Attualmente ci sono quattro PARPi approvati dalla FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (chiamato anche BMN 673), che vengono utilizzati per vari trattamenti per il cancro al seno e alle ovaie11. Tuttavia, la resistenza PARPi è comune e una potenziale causa sorge attraverso la riacquisizione della competenza HR12. La perdita o l'inibizione di PARP-1 in presenza di irradiazione disregola il meccanismo del resettosoma, portando all'accumulo di tratti ssDNA più lunghi13. Pertanto, uno studio approfondito della resezione del DNA in vivo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e il successivo sviluppo di nuove strategie per trattare il cancro e superare la resistenza al PARPi.
Ci sono stati diversi metodi impiegati per rilevare gli eventi di resezione del DNA5. Uno di questi metodi è la classica tecnica basata su IF che consente la colorazione indiretta e la visualizzazione del DNA resecato dopo DSB indotto da stress utilizzando un anticorpo anti-RPA. Etichettare il DNA genomico con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU) e rilevare solo ssDNA è una misura diretta degli eventi di resezione del DNA. Aggira il monitoraggio dell'RPA, che è coinvolto in più processi cellulari come la replicazione del DNA. Nel metodo qui descritto, le cellule incubate con BrdU per un singolo ciclo cellulare consentono a BrdU di essere incorporato in un filamento del DNA cellulare replicante. Dopo la resezione, la colorazione IF viene eseguita in condizioni che consentono il rilevamento di BrdU solo nella forma ssDNA, con l'uso di un anticorpo anti-BrdU. Questo anticorpo può accedere solo ai nucleotidi BrdU esposti e non rileverà quelli integrati nel DNA a doppio filamento. Utilizzando la microscopia a fluorescenza, il DNA resecato può essere visualizzato sotto forma di focolai puntati brdU / ssDNA. L'intensità nucleare di questi fuochi può essere utilizzata come lettura per quantificare la resezione a seguito di danno al DNA. Questo documento descrive passo dopo passo i processi di questo metodo, che può essere applicato alla maggior parte delle linee cellulari di mammiferi. Questo metodo dovrebbe essere di ampia utilità come un modo semplice per monitorare la resezione finale del DNA nel cellulo, come prova di concetto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

Lo studio della risposta al danno al DNA (DDR) è un campo complesso ed essenziale, che è diventato più importante solo a causa dell'uso di farmaci mirati alla DDR per il trattamento del cancro. Questi bersagli sono poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), che avviano varie forme di riparazione del DNA. L'inibizione di questi enzimi utilizzando inibitori PARP (PARPi) raggiunge una letalità sintetica conferendo una vulnerabilità terapeutica nelle cellule carenti di ricombinazione omologa (HR) a causa di mutazioni nel cancro al seno di tipo 1 (BRCA1), BRCA2 o partner e localizzatore di BRCA2 (PALB2). 
Le cellule trattate con PARPi accumulano rotture a doppio filamento di DNA (DSB). Queste rotture vengono elaborate dal meccanismo di resezione finale del DNA, portando alla formazione di DNA a singolo filamento (ss) e alla successiva riparazione del DNA. In un contesto carente di BRCA1, la resezione rinvigorente del DNA attraverso mutazioni in inibitori della resezione del DNA, come 53BP1 e DYNLL1, causa resistenza al PARPi. Pertanto, essere in grado di monitorare la resezione del DNA nel cellulo è fondamentale per una comprensione più chiara dei percorsi di riparazione del DNA e lo sviluppo di nuove strategie per superare la resistenza al PARPi. Le tecniche basate sull'immunofluorescenza (IF) consentono il monitoraggio della resezione globale del DNA dopo il danno al DNA. Questa strategia richiede l'etichettatura del DNA genomico a impulsi lunghi con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU). Dopo il danno al DNA e la resezione finale del DNA, il DNA a singolo filamento risultante viene specificamente rilevato da un anticorpo anti-BrdU in condizioni native. Inoltre, la resezione del DNA può anche essere studiata utilizzando marcatori del ciclo cellulare per differenziare tra le varie fasi del ciclo cellulare. Le cellule nella fase S/G2 consentono lo studio della resezione finale all'interno di HR, mentre le cellule G1 possono essere utilizzate per studiare l'unione finale non omologa (NHEJ). Un protocollo dettagliato per questo metodo IF accoppiato alla discriminazione del ciclo cellulare è descritto in questo documento.

In questo protocollo, il saggio basato sulla bromodeossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per misurare quantitativamente la risposta di resezione delle cellule HeLa al danno indotto dall'irradiazione. Le tracce di ssDNA generate vengono visualizzate come focolai distinti dopo la colorazione di immunofluorescenza (Figura 1A). I focolai identificati sono stati quindi quantificati ed espressi come l'intensità totale integrata della colorazione BrdU nei nuclei (Figura 1B</...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Nel presente protocollo, dimostriamo come visualizzare la resezione finale a doppio filamento del DNA durante la fase S/ G2 del ciclo cellulare utilizzando un metodo basato sull'immunofluorescenza.

Valutazione della resezione finale globale a doppio filamento del DNA utilizzando l'etichettatura BrdU-DNA abbinata all'imaging di discriminazione del ciclo cellulare

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Questo protocollo consente la quantificazione in cellulo del DNA e la resezione a seguito di danni al DNA. Il principale vantaggio di questa tecnica è la marcatura del ciclo cellulare che limita le cellule alla fase S e G2, assicurando che il segnale bromodeossiuridina derivi dal DNA e dalla resezione. A dimostrare la procedura saranno Jean-Yves Masson, ricercatore principale, e Sofiane Y.Mersaoui, ricercatrice post-dottorato.Lavorando sotto una cappa di coltura sterile, posizionare un singolo coperchio in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti per tutte le condizioni necessarie. Piastra circa 150.000 cellule HeLa per la trasfezione o il trattamento farmacologico. Il terzo giorno, dopo l'incubazione notturna con BrdU ad una concentrazione finale di 10 micromolari, irradiare le piastre con una dose totale di cinque grigi di irradiazione a raggi X.Dopo l'irradiazione, restituire le piastre per l'incubazione a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di ossido di carbonio per tre ore. Per la pre-estrazione, aspirare il mezzo e lavare accuratamente le celle due volte con PBS. Dopo aver rimosso PBS, aggiungere due millilitri di tampone di pre-estrazione A e incubare le cellule a quattro gradi Celsius sul ghiaccio per 10 minuti.Dopo 10 minuti, aspirare il tampone A, aggiungere due millilitri di tampone di stripping del citoscheletro B e ripetere l'incubazione. Quindi aspirare accuratamente il tampone B e lavare le cellule con PBS. Dopo aver aspirato PBS, fissare le celle aggiungendo due millilitri del 4% di paraformaldeide sotto il cappuccio chimico.Dopo la rimozione della paraformaldeide e lava con PBS, coprire i coverslip con metanolo freddo al 100% per l'incubazione a meno 20 gradi Celsius per cinque minuti e lavare i coverslips due volte con PBS. Per la permeabilizzazione, incubare le cellule con due millilitri di PBS contenenti lo 0,5% di Tritan X-100 a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, lavare le coperture tre volte con due millilitri di PBS.Per l'immunocolorazione, aggiungere due millilitri di tampone bloccante a ciascun pozzetto. Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale primaria a ciascun coverslip. Utilizzare una pinzetta per coprire le coperture con parafilm quadrato e posizionare con attenzione il parafilm per non creare bolle.Quindi coprire la piastra in un foglio di alluminio e incubare l'anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius in una camera umidificata. Il giorno seguente, rimuovere i quadrati di parafilm e lavare i coperchi tre volte con due millilitri di PBS. Dopo il lavaggio, aggiungere 100 microlitri di soluzione anticorpale secondaria su ogni coverslip e coprire i coverslip con un quadrato di parafilm come dimostrato.Incubare l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per un'ora e proteggere la piastra dalla luce usando un foglio. Quindi lavare le coverslip tre volte con due millilitri di 1X PBS. Per la colorazione nucleare, aggiungere due millilitri di soluzione DAPI a ciascun coperchio e lavare i coperchi con PBS.Aggiungere da 10 a 20 microlitri di mezzo di montaggio specifico per IF sui vetrini del microscopio. Utilizzare l'ago o una pinzetta fine per sollevare la slitta dal fondo del pozzo. Asciugare accuratamente il liquido in eccesso picchiettando delicatamente un bordo su un tovagliolo di carta e montare i coperchi sui vetrini del microscopio.Per l'acquisizione e l'analisi delle immagini, importare questi file in CellProfiler e analizzarli utilizzando la pipeline di conteggio delle macchie. Identificare l'oggetto primario per identificare i fuochi utilizzando le impostazioni descritte nel manoscritto di testo e misurare l'intensità. Qui vengono mostrate immagini rappresentative della formazione di focolai di 5-bromo-2-prime-deossiuridina e della colorazione proliferante dell'antigene nucleare cellulare dopo l'irradiazione.Le tracce di DNA a singolo filamento generate sono state visualizzate come focolai distinti. I focolai identificati sono stati quindi quantificati ed espressi come l'intensità totale integrata della colorazione bromodeossiuridina nei nuclei. La co-colorazione ha mostrato una differenziazione tra la resezione a corto raggio dovuta all'unione finale non omologa e la resezione a lungo raggio della ricombinazione omologa utilizzando un anticorpo anti-PCNA per identificare le cellule che attraversano la fase S.Il PCNA è prominente nel nucleo e raggiunge la massima espressione durante la fase S del ciclo cellulare con una colorazione piuttosto intensa. I valori risultanti vengono quindi tracciati come un grafico a dispersione per discriminare tra nuclei PCNA positivi e PCNA negativi. I risultati negativi pcNA vengono rimossi dal set di dati per consentire l'analisi basata sull'intensità BrdU a causa del segnale BrdU basso indipendentemente dalla condizione.I nuclei negativi pcna ospitano un'intensità basale integrata di focolai BrdU di 900 unità arbitrarie e questo valore raggiunge 1.800 UA nei nuclei positivi al PCNA. Nella condizione di controllo del siRNA, l'intensità integrata dei focolai di BrdU per nucleo è di circa 1.500 UA nei nuclei PCNA positivi. Dopo un efficace abbattimento di PARP-1 utilizzando un siRNA, è stato osservato un aumento significativo dell'intensità dei focolai di BrdU a circa 1.900 UA.Questa tecnica può fornire informazioni chiave sul primo stadio della ricombinazione omologa, aiutando così a identificare se una proteina è coinvolta nella prima fase del percorso di riparazione. Il tempo di incubazione per i tamponi di pre-estrazione deve essere rigorosamente mantenuto. La sovraesposizione a questi tamponi comporterà un eccessivo distacco cellulare e un aumento del segnale di fondo.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Ricerca

Biologia

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

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Analisi del DNA doppio filamento Break (DSB) di riparazione in cellule di mammifero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Analisi del ciclo cellulare dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; I tessuti utilizzando l&#39;Sintonizzatevi Acoustic Concentrandosi Cytometer e Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...