Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
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マリー=クリスティーヌ・キャロンの卓越した技術的アドバイスに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所J.Y..M(CIHR FDN-388879)からの資金提供によって支えられています。J.-Y..M.は、DNA修復およびがん治療のTier 1カナダ研究委員長を務めています。J.O'SはFRQS博士課程の学生フェローであり、S.Y.MはFRQSポスドクフェローです。

1. 細胞培養、処理、およびカバースリップの準備
注: すべての細胞プレーティング、トランスフェクション、および処理は、照射を除き、滅菌細胞培養フードの下で行う必要があります。
<ol><li>1日目<ol>
<li>6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処?...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

本稿では、IF染色を用いてセルロのDNA切除の変動を測定する方法について説明する。DNA切除への影響を観察するための現在の標準は、RPA染色によるものです。しかし、これはDNA複製の影響を受ける可能性のある間接的な方法です。以前に、BrdU陽性およびBrdU陰性細胞において生じる強度を分類するための別のBrdU組み込みベースのDNA切除IF技術が記載されていた。この方法により、HRを受?...

DNA修復因子の調節は、特にDNA DSB修復不全腫瘍環境において、がん治療のための絶えず進化する方法である。特定の修復因子の阻害は、DNA損傷物質に対して癌細胞を感作するために使用される独創的な戦略の1つである。何十年にもわたる研究の結果、DNA修復遺伝子のさまざまな変異が、治療戦略の選択のためのバイオマーカーとして同定されました1。その結果、DNA修復分野は、幅広い治療を確実にするための医薬品開発のハブとなり、個別化医療の概念を強化しています。 
DSBは、NHEJとHR2の2つの主要な経路によって修復されます。NHEJ経路はエラーが発生しやすく、DNAエンドプロセシングをほとんどまたはまったく行わずに2つのDNA末端を迅速にライゲーションし、プロテインキナーゼ(DNA-PKcs)、Ku70/80複合体、53BP1、およびRIF1タンパク質3が関与します。対照的に、HRはBRCA14によって開始された忠実なメカニズムです。HR修復に不可欠なステップはDNA末端切除プロセスであり、これは3'-OH末端を有する一本鎖(ss)DNAにつながる切断末端の分解である。BRCA1は、5'~3'DNA切除に関与する切除体MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1を形成する下流タンパク質のリクルートを促進します5。
初期末端切除は、MRE11のエンドヌクレアーゼ活性を介して達成され、DNA2およびEXO1ヌクレアーゼによるさらなる処理を可能にする。生成されたssDNAオーバーハングは、レプリケーションプロテインA(RPA)によって迅速にコーティングされ、さらなる処理から保護されます。続いて、BRCA2、PALB2、およびBRCA1は、RPAの変位および相同性指向性修復機構に必要なRAD51ヌクレオフィラメントの組み立てを媒介するために関与する。NHEJとHRの使用の微妙なバランスは、ゲノム完全性の最適な維持のために必要である。経路の選択は、細胞周期の段階に依存する。HRは、DNA切除が最高レベルにあるS期からG2期にかけて優先的に使用され、姉妹染色分体が適切な修復を確実にするために利用可能である。
ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP-1)は、DSBにリクルートされた最も初期のタンパク質の1つである。これは、切除活性とNHEJ5,6に関与する下流エフェクターの組み立ての両方を調節する。PARP-1は、複製中のDNA一本鎖切断修復にも必要です7,8。DNA修復におけるその重要な役割のために、PARP阻害剤(PARPi)は癌治療として使用されている。いくつかのHR欠損がんにおいて、PARPi治療は、代替経路を介して蓄積された損傷を修復するHR欠損細胞の能力がないため、合成致死的応答をもたらす9,10。現在、FDAが承認したPARPiは、オラパリブ、ルカパリブ、ニリパリブ、タラゾパリブ(BMN 673とも呼ばれる)の4種類で、乳がんや卵巣がんのさまざまな治療に使用されています11。しかし、PARPi耐性は一般的であり、1つの潜在的な原因は、HR能力の再獲得によって生じる12。照射の存在下でのPARP−1の喪失または阻害は、切除体機構を調節不全にし、より長いssDNA経路の蓄積をもたらす13。したがって、インビボでのDNA切除の詳細な研究は、DNA修復経路のより明確な理解と、その後のがん治療およびPARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要である。
DNA切除イベントを検出するためにいくつかの方法が採用されています5。そのような方法の1つは、抗RPA抗体を使用してストレス誘発DSB後に切除されたDNAの間接染色および可視化を可能にする古典的なIFベースの技術である。ゲノムDNAを5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)で標識し、ssDNAのみを検出することは、DNA切除事象の直接測定です。これは、DNA複製などの複数の細胞プロセスに関与するRPAのモニタリングを回避します。本明細書に記載の方法では、単一細胞周期の間BrdUと共にインキュベートされた細胞は、BrdUが複製細胞DNAの1本の鎖に組み込まれることを可能にする。切除に続いて、IF染色は、抗BrdU抗体の使用により、ssDNA形態においてのみBrdU検出を可能にする条件下で行われる。この抗体は、露出したBrdUヌクレオチドにのみアクセスでき、二本鎖DNAに組み込まれたものは検出しません。蛍光顕微鏡を用いて、切除されたDNAを点状BrdU/ssDNA病巣の形で可視化することができる。これらの病巣の核強度は、DNA損傷後の切除を定量化するための読み出しとして使用することができる。この論文では、ほとんどの哺乳動物細胞株に適用できるこの方法のプロセスを段階的に説明します。この方法は、セル ロのDNA末端切除をモニタリングする簡単な方法として、概念実証として幅広い有用性を持つべきである。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

DNA損傷応答(DDR)の研究は複雑で不可欠な分野であり、がん治療にDDR標的薬を使用することで重要性が増しています。これらの標的はポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PRP)であり、様々な形態のDNA修復を開始する。PARP阻害剤(PARPi)を用いてこれらの酵素を阻害することは、乳癌1型(BRCA1)、BRCA2、またはBRCA2のパートナーおよび局在化器(PALB2)の変異による相同組換え(HR)欠損細胞に治療上の脆弱性を与えることによって合成致死性を達成する。 
PARPiで処理された細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)を蓄積する。これらの切断はDNA末端切除機構によって処理され、一本鎖(ss)DNAの形成およびその後のDNA修復につながる。BRCA1欠損の状況では、53BP1やDYNLL1などのDNA切除阻害剤の変異を介してDNA切除を再活性化すると、PARPi耐性が引き起こされます。したがって、 セルロ のDNA切除をモニターできることは、DNA修復経路のより明確な理解と、PARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要です。免疫蛍光(IF)ベースの技術により、DNA損傷後のグローバルDNA切除のモニタリングが可能になります。この戦略には、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)によるロングパルスゲノムDNA標識が必要です。DNA損傷およびDNA末端切除に続いて、得られた一本鎖DNAは、天然条件下で抗BrdU抗体によって特異的に検出される。さらに、DNA切除は、細胞周期の様々な段階を区別するために細胞周期マーカーを用いて研究することもできる。S/G2期の細胞はHR内の末端切除の研究を可能にするが、G1細胞は非相同末端結合(NHEJ)の研究に使用することができる。細胞周期弁別に結合されたこのIF法の詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。

このプロトコールでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)ベースのアッセイを使用して、放射線誘発損傷に対するHeLa細胞の切除応答を定量的に測定した。生成されたssDNAトラックは、免疫蛍光染色後に別個の病巣として可視化される(図1A)。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるBrdU染色の総積分強度として表した(図1B、補足図S1、補足図<stron...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

このプロトコルは、DNAのセルロ定量およびDNA損傷後の切除を可能にする。この技術の主な利点は、細胞をS期およびG2期に制限し、DNAおよび切除から生じるブロモデオキシウリジンシグナルを確実にする細胞周期マーキングである。この手順を実証するのは、主任研究者のJean-Yves Massonとポスドク研究者のSofiane Y.Mersaouiです。滅菌培養フードの下で作業し、必要な数の条件のために、6ウェルプレートの各ウェルに単一のカバースリップを置きます。トランスフェクションまたは薬物処理のために約150,000個のHeLa細胞をプレートする。3日目に、終濃度10マイクロモルのBrdUとの一晩インキュベーションに続いて、5グレイのX線照射の総用量でプレートを照射する。照射後、プレートを37°Cで5%の二酸化炭素加湿インキュベーターに3時間戻してインキュベートする。予備抽出のために、培地を吸引し、PBSで細胞を2回注意深く洗浄する。PBSを除去した後、2ミリリットルの抽出前バッファーAを加え、細胞を氷上で摂氏4度で10分間インキュベートする。10分後、吸引バッファーA、細胞骨格剥離バッファーBを2ミリリットル加え、インキュベーションを繰り返した。その後、バッファーBを注意深く吸引し、PBSで細胞を洗浄する。PBSを吸引した後、化学フードの下に2ミリリットルの4%のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定する。パラホルムアルデヒドを除去してPBSで洗浄した後、カバースリップを100%冷たいメタノールで覆い、マイナス20°Cで5分間インキュベートし、カバースリップをPBSで2回洗浄します。透過処理のために、細胞を0.5%Tritan X-100を含む2ミリリットルのPBSと共に室温でインキュベートする。15分後、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回洗う。免疫染色のために、各ウェルに2ミリリットルのブロッキングバッファーを加える。1時間のインキュベーション後、100マイクロリットルの一次抗体溶液を各カバースリップに加える。ピンセットを使用してカバースリップを正方形のパラフィルムで覆い、泡を作らないようにパラフィルムを慎重に配置します。次いで、プレートをアルミニウム箔で覆い、加湿チャンバー内で一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、パラフィルムの正方形を取り除き、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回洗う。洗浄後、各カバースリップに100マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、実証されているように正方形のパラフィルムでカバースリップを覆う。二次抗体を室温で1時間インキュベートし、ホイルを使用してプレートを光から保護します。その後、カバースリップを2ミリリットルの1X PBSで3回洗ってください。核染色の場合は、各カバースリップに2ミリリットルのDAPI溶液を加え、カバースリップをPBSで洗浄します。顕微鏡スライドに10~20マイクロリットルのIF特異的マウント媒体を加えます。針または細かいピンセットを使用して、カバースリップを井戸の底から持ち上げます。ペーパータオルの片方の端を軽く叩いて余分な液体を慎重に拭き取り、カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けます。画像の取得と分析を行うには、これらのファイルを CellProfiler にインポートし、スペックルカウントパイプラインを使用して分析します。テキスト原稿に記載されている設定を使用して病巣を識別するための主要なオブジェクトを特定し、強度を測定します。照射後の5-ブロモ-2-プライムデオキシウリジン病巣形成および増殖細胞核抗原染色の代表的な像をここに示す。生成された一本鎖DNAトラックを、別個の病巣として可視化した。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるブロモデオキシウリジン染色の総積分強度として表した。共染色は、S期を経る細胞を同定するために抗PCNA抗体を用いた非相同末端結合による短距離切除と相同組換えの長距離切除との間の分化を示した。PCNAは核内で顕著であり、細胞周期のS期に極めて強い染色で最大発現に達する。次に、値の結果を散布図としてプロットし、PCNA 陽性核と PCNA 負核を判別します。PCNA 陰性の結果はデータセットから削除され、条件に関係なく BrdU 信号が低いため、BrdU 強度ベースの解析が可能になります。PCNA負性核は、900単位のBrdU病巣の基礎積分強度を保有し、この値はPCNA正核において1,800AUに達する。siRNA対照条件において、核当たりのBrdU病巣の集積強度は、PCNA陽性核において約1,500AUである。siRNAを用いたPARP−1の効率的なノックダウンの後、BrdU病巣の強度の約1,900AUへの有意な増加が観察された。この技術は、相同組換えの第1段階に関する重要な洞察を提供し、したがって、タンパク質が修復経路の第1段階に関与しているかどうかを同定するのに役立つ。抽出前バッファーのインキュベーション時間は厳密に保持する必要があります。これらのバッファーへの過剰暴露は、過剰な細胞剥離およびバックグラウンドシグナルの増加をもたらす。

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

の生細胞サイクル分析<em&gt;ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとVybrant DyeCycleバイオレットDNA染色を使用して&gt;組織

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...