Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
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우리는 뛰어난 기술 적 조언에 대한 마리 크리스틴 카론 감사합니다. 이 작품은 건강 연구 J.Y.M (CIHR FDN-388879)의 캐나다 연구소에서 자금 지원을 받고 있습니다. J.-Y.M. DNA 수리 및 암 치료제에서 1단계 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다. J.O'S는 FRQS 박사 과정 학생 펠로우이며, S.Y.M박사 후 펠로우입니다.

1. 세포 배양, 치료 및 커버 슬립 준비
참고: 모든 세포 도금, 경질 및 치료는 조사 외에도 멸균 세포 배양 후드 에서 이루어져야 합니다.
<ol><li>1일차<ol>
<li>6웰 플레이트에 필요한 만큼의 조건에 대해 각각 하나의 커버슬립을 배치합니다. 플레이트 ~150,000 Fefection 또는 약물 치료를 위한 HeLa 세포, 원하는대로. 참고: 횡단하는 경우 도금 시 역경을 하는 것이 좋습니다. 역성 형?...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

이 논문은 셀룰로의 DNA 절제술의 변이를 측정하기 위해 IF 염색을 사용하는 방법을 설명합니다. DNA 절제술에 대한 효과를 관찰하기위한 현재 표준은 RPA 염색을 통해; 그러나, 이것은 DNA 복제에 의해 영향을 받을 수 있는 간접적인 방법입니다. 이전에는 BrdU-정산 DNA 절제술 IF 기술이 BrdU 양성 및 BrdU-음성 세포의 결과로 발생하는 강도를 분류하기 위해 설명되었습니다. 이 방법은 HR을 거치지 ?...

DNA 수리 인자의 변조는 암 치료를 위한 끊임없이 진화하는 방법, 특히 DNA DSB 복구 결핍 종양 환경에서. 특정 수리 요인의 억제는 DNA 손상 에이전트에 암세포를 민감하게 하는 데 사용 되는 독창적인 전략 중 하나입니다. 연구의 수십 년 치료 전략 선택에 대 한 바이오 마커로 DNA 복구 유전자의 다양 한 돌연변이의 식별으로 주도 1. 결과적으로 DNA 수리 분야는 다양한 치료법을 보장하기 위한 약물 개발의 허브가 되어 개인화된 의학 개념을 강화합니다. 
DSB는 NHEJ와 HR2의 두 가지 주요 경로에 의해 수리됩니다. NHEJ 통로는 오류가 발생하기 쉽고, 두 DNA 끝을 DNA 최종 처리가 거의 또는 전혀 없이 빠르게 결합하고 단백질 키나아제(DNA-PKcs), Ku70/80 복합체, 53BP1 및 RIF1 단백질3와 관련이 있습니다. 대조적으로, HR은 BRCA14에 의해 시작된 충실한 기계장치입니다. HR 수리의 필수적인 단계는 DNA-말 절제 과정으로, 이는 3'-OH 끝이 있는 단면(ss) DNA로 이어지는 깨진 끝의 저하입니다. BRCA1은 5'에서 3'DNA 절제술5에 관여하는 절제된 MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1을 형성하는 다운스트림 단백질의 모집을 용이하게 합니다.
초기 말절제는 MRE11의 엔도나클레스 활성을 통해 달성되어 DNA2 및 EXO1 뉴클레아제에 의한 추가 처리를 가능하게 한다. 생성된 ssDNA 오버행은 복제 단백질 A(RPA)에 의해 신속하게 코팅되어 추가 처리로부터 보호합니다. 그 후, BRCA2, PALB2 및 BRCA1은 상동성 지향 수리 메커니즘에 필요한 RPA의 변위와 RAD51 핵필라멘트의 조립을 중재하기 위해 관여한다. 유전체 무결성의 최적 유지 보수를 위해서는 NHEJ와 HR의 사용 사이의 미세한 균형이 필요합니다. 통로 선택은 세포 주기 단계에 달려 있습니다. HR은 DNA 절제술이 최고 수준에 있는 것을 내다의 S에서 G2 단계 도중 우대적으로 이용되고, 자매 크로마티드는 적당한 수리를 지키기 위하여 유효합니다.
폴리(ADP-ribose) 폴리머라제 1(PARP-1)은 DSB에 채용된 초기 단백질 중 하나입니다. 그것은 NHEJ5,6에 관련 된 하류 효과의 절제술 활동 및 조립을 모두 조절. PARP-1은 복제 7,8 동안 DNA 단일 좌초 휴식 수리에도 필요합니다. DNA 수리에 있는 그것의 중요한 역할 때문에, PARP 억제제 (PARPi)는 암 치료로 이용됩니다. 몇몇 HR 결핍암에서, PARPi 처리는 대체 통로를 통해 축적된 손상을 복구하기 위하여 HR 결핍세포의 무능력 때문에 합성 치명적인 반응으로 이끌어 냅니다9,10. 현재 4개의 FDA 승인 PARPi가 있습니다: 올라파리브, 루카파립, 니리파립, 탈라조파립(BMN 673이라고도 함) 등 다양한 유방암 및 난소암 치료에 사용됩니다11. 그러나 PARPi 저항은 일반적이며, HR 능력의 재수집을 통해 하나의 잠재적 인 원인이 발생12. 조사 의 존재에 PARP-1의 손실 또는 억제는 방부성 기계를 조절, 더 긴 ssDNA 기관13의 축적으로 이어지는. 따라서 생체 내 DNA 절제술에 대한 심층 연구는 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 암을 치료하고 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 후속 개발에 매우 중요합니다.
DNA 절제술 이벤트를 검출하기 위하여 채택된 몇몇 방법이 있었습니다5. 이러한 방법 중 하나는 반대로 RPA 항체를 이용하여 스트레스 유도 DSB 후 절제된 DNA의 간접 염색 및 시각화를 허용하는 고전적인 IF 기반 기술이다. 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)로 게놈 DNA를 표시하고 ssDNA만 검출하는 것은 DNA 절제술 이벤트의 직접적인 측정입니다. 그것은 DNA 복제와 같은 다중 세포 프로세스에 관여하는 RPA의 감시를 우회합니다. 여기서 설명된 방법에서, 단일 세포 주기를 위해 BrdU와 함께 배양된 세포는 BrdU가 복제 세포 DNA의 한 가닥으로 통합될 수 있게 한다. 다음 절제술, IF 염색은 BrdU가 ssDNA 형태로만 검출할 수 있도록 하는 조건하에서 수행되며, 반대로 BrdU 항체를 사용한다. 이 항체는 노출된 BrdU 뉴클레오티드에만 접근할 수 있으며 이중 좌초 된 DNA에 통합 된 것을 감지하지 않습니다. 형광 현미경 검사를 사용하여, 절제된 DNA는 BrdU/ssDNA foci를 천시테이트의 형태로 시각화할 수 있습니다. 이러한 포시의 핵 강도는 DNA 손상 에 따라 절제술을 정량화하기 위한 판독선으로 사용될 수 있다. 이 논문은 대부분의 포유류 세포주에 적용될 수 있는 이 방법의 과정을 단계별로 설명합니다. 이 방법은 개념의 증거로 셀룰로에서 DNA 끝 절제술을 모니터링하는 간단한 방법으로 광범위한 유틸리티가어야합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

DNA 손상 반응(DDR)의 연구는 복잡하고 필수적인 분야이며, 이는 암 치료를 위한 DDR 표적 약물의 사용으로 인해 더욱 중요해졌습니다. 이러한 표적은 다양한 형태의 DNA 수리를 시작하는 폴리(ADP-ribose) 폴리머라제(PARP)입니다. PARP 억제제(PARPi)를 사용하여 이러한 효소를 억제하는 것은 유방암 유형 1(BRCA1), BRCA2 또는 BRCA2(PALB2)의 파트너 및 국소화로 인한 동종 재조합(HR)-결핍세포에 대한 치료적 취약성을 부여하여 합성 치사를 달성한다. 
PARPi로 처리된 세포는 DNA 이중 가닥 휴식(DSBs)을 축적한다. 이러한 휴식은 DNA 끝 절제 기계에 의해 처리되며, 단일 좌초 (ss) DNA 및 후속 DNA 수리의 형성으로 이어진다. BRCA1 결핍 맥락에서, DNA 절제술 억제제의 돌연변이를 통해 DNA 절제술을 통해 DNA 절제술을 재활성화, 와 같은 53BP1 및 DYNLL1, PARPi 저항을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 셀룰로에서 DNA 절제술을 모니터링할 수 있는 것은 DNA 수리 경로에 대한 명확한 이해와 PARPi 저항을 극복하기 위한 새로운 전략의 개발에 매우 중요합니다. 면역 형광 (IF) 기반 기술은 DNA 손상 후 글로벌 DNA 절제술의 모니터링을 허용합니다. 이 전략은 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)와 긴 펄스 게놈 DNA 라벨을 필요로합니다. DNA 손상 및 DNA 끝 절제술에 이어, 생성된 단일 좌초 DNA는 네이티브 조건하에서 항 BrdU 항체에 의해 구체적으로 검출된다. 더욱이, DNA 절제술은 세포 주기 마커를 사용하여 세포 주기의 다양한 단계를 구별하는 연구될 수 있다. S/G2 상에 있는 세포는 G1 세포가 비 동형 종결합 (NHEJ)를 연구하기 위하여 이용될 수 있는 반면, HR 내의 끝 절제술의 연구를 허용합니다. 세포 주기 차별과 결합된 이 IF 방법에 대한 자세한 프로토콜은 이 논문에 설명되어 있습니다.

이 프로토콜에서, 브로모톡시리딘(BrdU)-기반 분석체는 조사 유도손상에 대한 HeLa 세포의 절제 반응을 정량적으로 측정하는 데 사용되었다. 생성된 ssDNA 트랙은 면역 형광 염색 후 뚜렷한 초점으로 시각화됩니다 (도 1A). 확인된 포시는 핵에서 BrdU 염색의 총 통합 강도로 정량화되고 발현되었다(도 1B, 보충 도도 S1, 보충 도S2, 및 보충 도 S...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.

세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

이 프로토콜은 DNA 손상에 따라 DNA 및 절제술의 셀룰로 정량화를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포를 S 및 G2 단계로 제한하는 세포 주기 표시로 DNA 및 절제에서 브로모톡옥우리딘 신호 결과를 보장합니다. 절차를 보여주는 것은 장 이브 매슨, 주요 조사자, 그리고 소피아네 Y.Mersaoui, 박사 후 연구원이 될 것입니다.멸균 배양 후드 아래에서 작업하면 필요한 만큼의 조건에 따라 6웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립을 배치합니다. 약 150, 000 HeLa 세포를 경질 또는 약물 치료를 위한 플레이트. 셋째 날, BrdU와의 하룻밤 잠복에 이어 10 마이크로몰라의 최종 농도에서 총 5개의 회색의 X선 조사 용량으로 플레이트를 조사합니다.조사 후, 3 시간 동안 5 %의 탄소 산화가중증 인큐베이터에서 37섭씨37도에서 배양판을 반환하십시오. 사전 추출을 위해, 매체를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 조심스럽게 씻으세요. PBS를 제거한 후, 추출 전 버퍼 A의 2밀리리터를 추가하고 10분 동안 얼음에 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다.10분 후 흡인 버퍼 A는 사이토스켈레톤 스트리핑 버퍼 B의 2밀리리터를 추가하고 인큐베이션을 반복합니다. 그런 다음 조심스럽게 버퍼 B를 흡인하고 PBS로 세포를 씻으세요. PBS를 달린 후 화학 후드 아래에 파라포름알데히드의 4 %의 2 밀리리터를 추가하여 세포를 수정하십시오.파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 세척한 후, 커버립을 100% 차가운 메탄올로 덮고 5분간 영하 20도의 배양을 위해 커버립을 덮고 PBS로 커버립을 두 번 씻습니다. 투과성화를 위해 실온에서 0.5%트리탄 X-100을 함유한 PBS의 2밀리리터로 세포를 배양한다. 15분 후, PBS 의 2 밀리리터로 커버립을 세 번 씻습니다.면역 염색의 경우 각 웰에 블로킹 버퍼 2밀리리터를 추가합니다. 1시간 동안 잠복한 후 각 커버슬립에 1차 항체 용액 100마이크로리터를 추가합니다. 핀셋을 사용하여 커버립을 정사각형 파라필름으로 덮고 파라필름을 조심스럽게 배치하여 거품을 만들지 마십시오.그런 다음 알루미늄 호일로 판을 덮고 가습 챔버에서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1 차 항체를 배양합니다. 다음 날, 파라필름 사각형을 제거하고 PBS의 두 밀리리터로 커버립을 세 번 세척합니다. 세척 후 각 커버슬립에 100마이크로리터의 이차 항체 용액을 추가하고 설명한 대로 파라필름 사각형으로 커버커버립을 덮습니다.이차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고 호일을 사용하여 빛으로부터 플레이트를 보호합니다. 그런 다음 1X PBS의 2 밀리리터로 커버립을 세 번 씻습니다. 핵 염색의 경우 각 커버슬립에 DAPI 용액 2밀리리터를 추가하고 PBS로 커버립을 세척합니다.현미경 슬라이드에 IF 특이 장착 배지10~20마이크로리터를 추가합니다. 바늘이나 미세 핀셋을 사용하여 우물 바닥에서 덮개 슬립을 들어 올립니다. 종이 타월에 한 가장자리를 부드럽게 두드리고 현미경 슬라이드에 커버립을 장착하여 여분의 액체를 조심스럽게 제거합니다.이미지 수집 및 분석을 위해 이러한 파일을 CellProfiler로 가져오고 반점 계수 파이프라인을 사용하여 분석합니다. 텍스트 원고에 설명된 설정을 사용하여 foci를 식별하고 강도를 측정하기 위해 기본 개체를 식별합니다. 5-브로모-2-프라임-데옥시리딘 포시 형성 및 증식 세포 핵 항원 염색 의 대표적인 이미지는 조사 후 여기에 도시된다.생성된 단일 좌초 DNA 트랙은 뚜렷한 초점으로 시각화되었다. 확인된 포시는 그 때 정량화되고 핵에서 브로모톡옥수리딘 염색의 총 통합 강도로 표현되었다. 공동 염색은 비동상종 결합및 항PCNA 항체를 이용하여 동종재조합의 장거리 절제술으로 인한 단거리 절제술 간의 분화를 보여 S상을 통과하는 세포를 식별하였다.PCNA는 핵에서 두드러지며 세포 주기의 S 단계 동안 매우 강렬한 염색을 통해 최대의 발현에 도달한다. 그 결과 값은 PCNA 양성 핵과 PCNA 음성 핵을 구별하기 위한 산란플롯으로 플롯됩니다. PCNA 음의 결과는 조건에 관계없이 낮은 BrdU 신호로 인해 BrdU 강도 기반 분석을 허용하기 위해 데이터 집합에서 제거됩니다.PCNA 음성 핵은 900 임의 단위의 BrdU 초점의 기저 통합 강도를 항구하고 이 값은 PCNA 양성 핵에서 1, 800 AU에 도달합니다. siRNA 대조조건에서, 핵당 BrdU foci의 통합 강도는 PCNA 양성 핵에서 약 1, 500 AU이다. siRNA를 사용하여 PARP-1의 효율적인 낙폭 후, BrdU foci의 강도가 약 1, 900 AU로 크게 증가하는 것을 관찰했다.이 기술은 동종 재조합의 첫번째 단계에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 따라서 단백질이 수리 통로의 첫번째 단계에서 관련되어 있는지 확인하는 것을 돕습니다. 추출 전 버퍼의 인큐베이션 시간은 엄격하게 유지되어야 합니다. 이러한 버퍼에 과도하게 노출되면 과도한 세포 분리 및 증가된 배경 신호가 발생합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

광학 이미징과 비침습 감지를위한 형광 염료와 함께 줄기 세포를 라벨링

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

라이브 세포주기 분석<em&gt; 초파리</em조율 어쿠스틱 초점 cytometer에와 Vybrant DyeCycle 바이올렛 DNA 얼룩을 사용하여&gt; 조직

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

정량적 이미징 기법을 이용한 이종 세포 집단의 차별화 및 특성 규명

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...