Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Vi takker Marie-Christine Caron for fremragende tekniske råd. Dette arbeidet støttes av midler fra Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. har en Tier 1 Canada Research Chair i DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S er en FRQS ph.d.-stipendiat, og S.Y.M er en FRQS postdoktor.

1. Cellekultur, behandlinger og coverlip forberedelse
MERK: All cellebelegg, transfeksjoner og behandlinger, bortsett fra bestråling, bør foregå under en steril cellekultur hette.
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>I en 6-brønns plate, plasser en enkelt dekslelip i hver brønn for så mange forhold som nødvendig. Plate ~150,000 HeLa celler for transfeksjon eller narkotika behandling, etter ønske. MERK: Hvis transfekting, anbefales det å gjøre en omvendt transfeksjon på tidspunktet for plating...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Dette dokumentet beskriver en metode som gjør bruk av IF-farging for å måle variasjoner i DNA-reseksjon i cellulo. Den nåværende standarden for å observere en effekt på DNA-reseksjon er gjennom RPA-farging; Dette er imidlertid en indirekte metode som kan påvirkes av DNA-replikasjon. Tidligere har en annen BrdU-inkorporeringsbasert DNA-reseksjon IF-teknikk blitt beskrevet for å klassifisere de resulterende intensitetene i BrdU-positive og BrdU-negative celler. Denne metoden gjorde det mulig for celler so...

Modulering av DNA-reparasjonsfaktorer er en stadig utviklende metode for kreftbehandling, spesielt i DNA DSB-reparasjonsdefekterende tumormiljøer. Hemming av spesifikke reparasjonsfaktorer er en av de geniale strategiene som brukes til å sensibilisere kreftceller til DNA-skadelige midler. Tiår med forskning førte til identifisering av ulike mutasjoner av DNA-reparasjonsgener som biomarkører for terapeutiske strategivalg1. Derfor har DNA-reparasjonsfeltet blitt et knutepunkt for narkotikautvikling for å sikre et bredt spekter av behandlinger, og styrke det personlige medisinkonseptet. 
DSB-er repareres av to hovedveier: NHEJ og HR2. NHEJ-banen er feilutsatt, og ligaerer raskt de to DNA-endene med lite eller ingen DNA-sluttbehandling og involverer proteinkinase (DNA-PKcs), Ku70/80-komplekset, 53BP1 og RIF1 proteiner3. Hr er derimot en trofast mekanisme initiert av BRCA14. Et viktig skritt i HR-reparasjon er DNA-end reseksjonsprosessen, som er nedbrytningen av de ødelagte endene som fører til enkeltstrenget (ss) DNA med 3'-OH ender. BRCA1 legger til rette for rekruttering av nedstrømsproteiner som danner resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, som er involvert i 5' til 3' DNA-reseksjon5.
Den første end-reseksjonen oppnås gjennom endonukleaseaktiviteten til MRE11, noe som muliggjør videre behandling av DNA2- og EXO1-nukleasene. De genererte ssDNA-overhengene er raskt belagt av Replication Protein A (RPA) for å beskytte dem mot videre behandling. Deretter engasjerer BRCA2, PALB2 og BRCA1 seg for å megle forskyvningen av RPA og monteringen av RAD51-kjernen som kreves for homologistyrt reparasjonsmekanisme. En fin balanse mellom bruk av NHEJ og HR er nødvendig for optimalt vedlikehold av genomisk integritet. Banevalget avhenger av cellesyklusfasen. HR brukes fortrinnsvis i S til G2-fasene der DNA-reseksjon er på høyeste nivå, og søsterkromotidene er tilgjengelige for å sikre riktig reparasjon.
Poly (ADP-ribose) polymerase 1 (PARP-1) er et av de tidligste proteinene som rekrutteres til DSB. Det regulerer både reseksjonsaktivitet og montering av nedstrømseffektorer involvert i NHEJ5,6. PARP-1 er også nødvendig for DNA enkeltstrenget pausereparasjon under replikering7,8. På grunn av sin viktige rolle i DNA-reparasjon, brukes PARP-hemmere (PARPi) som kreftbehandlinger. I flere HR-mangelfulle kreftformer fører PARPi-behandling til en syntetisk dødelig respons på grunn av manglende evne til HR-mangelfulle celler for å reparere den akkumulerte skaden via en alternativ vei9,10. Det er for tiden fire FDA-godkjente PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib og Talazoparib (også kalt BMN 673), som brukes til ulike bryst- og eggstokkkreftbehandlinger11. PARPi-resistens er imidlertid vanlig, og en potensiell årsak oppstår gjennom reacquisition av HR-ferdigheter12. Tap eller hemming av PARP-1 i nærvær av bestråling dysregulaterer resectosome maskineri, noe som fører til akkumulering av lengre ssDNA-traktater13. Derfor er en grundig studie av DNA-reseksjon in vivo avgjørende for en klarere forståelse av DNA-reparasjonsveiene og den påfølgende utviklingen av nye strategier for å behandle kreft og for å overvinne PARPi-resistens.
Det har vært flere metoder for å oppdage DNA-reseksjonshendelser5. En slik metode er den klassiske IF-baserte teknikken som muliggjør indirekte farging og visualisering av det resekterte DNA etter stressindusert DSB ved hjelp av et anti-RPA-antistoff. Merking av genomisk DNA med 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) og detektering av bare ssDNA er en direkte måling av DNA-reseksjonshendelser. Den omgår overvåkingen av RPA, som er involvert i flere cellulære prosesser som DNA-replikering. I metoden beskrevet her, celler inkubert med BrdU for en enkelt celle syklus tillate BrdU å bli innlemmet i en tråd av replikering cellulære DNA. Etter reseksjon utføres IF-farging under forhold som tillater brdU-deteksjon bare i ssDNA-form, ved bruk av et anti-BrdU-antistoff. Dette antistoffet kan bare få tilgang til eksponerte BrdU-nukleotider og vil ikke oppdage de som er integrert i dobbeltstrenget DNA. Ved hjelp av fluorescensmikroskopi kan det resekterte DNA-et visualiseres i form av punktering brdU / ssDNA foci. Kjerneintensiteten til disse fociene kan brukes som en avlesning for å kvantifisere reseksjon etter DNA-skade. Dette dokumentet beskriver trinnvis prosessene for denne metoden, som kan brukes på de fleste pattedyrcellelinjer. Denne metoden bør være av bred nytte som en enkel måte å overvåke DNA end reseksjon i cellulo, som et konseptbevis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

Studien av DNA-skaderesponsen (DDR) er et komplekst og essensielt felt, som bare har blitt viktigere på grunn av bruk av DDR-målrettede legemidler til kreftbehandling. Disse målene er poly(ADP-ribose) polymeraser (PARPer), som initierer ulike former for DNA-reparasjon. Hemming av disse enzymene ved hjelp av PARP-hemmere (PARPi) oppnår syntetisk dødelighet ved å gi en terapeutisk sårbarhet i homolog rekombinasjon (HR)-mangelfulle celler på grunn av mutasjoner i brystkreft type 1 (BRCA1), BRCA2, eller partner og lokalisering av BRCA2 (PALB2). 
Celler behandlet med PARPi akkumulerer DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSBer). Disse pausene behandles av DNA-end reseksjonsmaskineri, noe som fører til dannelse av enkeltstrenget (ss) DNA og påfølgende DNA-reparasjon. I en BRCA1-mangelfull kontekst forårsaker gjenoppfriskning av DNA-reseksjon gjennom mutasjoner i DNA-reseksjonshemmere, som 53BP1 og DYNLL1, PARPi-resistens. Derfor er det viktig å kunne overvåke DNA-reseksjon i cellulo for en klarere forståelse av DNA-reparasjonsveiene og utviklingen av nye strategier for å overvinne PARPi-motstand. Immunfluorescens (IF)-baserte teknikker muliggjør overvåking av global DNA-reseksjon etter DNA-skade. Denne strategien krever genomisk DNA-merking med lang puls med 5-bromo-2′-deoksyuridin (BrdU). Etter DNA-skade og DNA-end reseksjon, blir det resulterende enkeltstrengede DNA spesielt oppdaget av et anti-BrdU-antistoff under innfødte forhold. Videre kan DNA-reseksjon også studeres ved hjelp av cellesyklusmarkører for å skille mellom ulike faser av cellesyklusen. Celler i S/G2-fasen tillater studiet av avsluttende reseksjon innen HR, mens G1-celler kan brukes til å studere ikke-homolog endeføyning (NHEJ). En detaljert protokoll for denne IF-metoden kombinert med cellesyklusdiskriminering er beskrevet i dette dokumentet.

I denne protokollen ble den bromodeksyuridinbaserte analysen (BrdU)-basert analyse brukt til kvantitativt å måle reseksjonsresponsen til HeLa-celler til bestrålingsindusert skade. De genererte ssDNA-sporene visualiseres som distinkte foci etter immunfluorescensfarging (figur 1A). Den identifiserte foci ble deretter kvantifisert og uttrykt som den totale integrerte intensiteten av BrdU-fargingen i kjernene (figur 1B, supplerende figur S1, supplerende f...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

I den nåværende protokollen demonstrerer vi hvordan man visualiserer DNA dobbeltstrenget end reseksjon under S / G2-fasen av cellesyklusen ved hjelp av en immunfluorescence-basert metode.

Vurdering av global DNA Double-Strand End Resection ved hjelp av BrdU-DNA-merking kombinert med cell cycle diskriminering imaging

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Denne protokollen muliggjør cellulo-kvantifisering av DNA og reseksjon etter DNA-skade. Denne teknikkens største fordel er cellesyklusmarkeringen som begrenser cellene til S- og G2-fase, noe som sikrer at bromodeksyuridinsignalet er et resultat av DNA og reseksjon. Demonstrere prosedyren vil være Jean-Yves Masson, en hovedetterforsker, og Sofiane Y.Mersaoui, en postdoktor.Arbeid under en steril kulturhette, plasser en enkelt dekslelip i hver brønn på en seksbrønnsplate for så mange forhold som trengs. Plate ca 150,000 HeLa celler for transfeksjon eller narkotika behandling. På dag tre, etter nattinkubasjonen med BrdU ved en endelig konsentrasjon på 10 mikromolar, bestråle platene med en total dose på fem grå røntgenbestråling.Etter bestråling, returner platene for inkubasjon ved 37 grader Celsius i en 5% karbonoksid fuktet inkubator i tre timer. For pre-ekstraksjon, aspirer mediet og vask cellene forsiktig to ganger med PBS. Etter å ha fjernet PBS, tilsett to milliliter pre-ekstraksjonsbuffer A og inkuber cellene ved fire grader Celsius på is i 10 minutter.Etter 10 minutter, aspirerer buffer A, tilsett to milliliter cytoskjelett stripping buffer B, og gjenta inkubasjonen. Deretter aspirerer du forsiktig buffer B og vasker cellene med PBS. Etter aspirerende PBS, fest cellene ved å legge til to milliliter 4% av paraformaldehyd under den kjemiske hetten.Etter fjerning av paraformaldehyd og vasker med PBS, dekk dekslene med 100% kald metanol for inkubasjon ved minus 20 grader Celsius i fem minutter og vask dekslene to ganger med PBS. For permeabilisering, inkuber cellene med to milliliter PBS som inneholder 0,5% Tritan X-100 ved romtemperatur. Etter 15 minutter, vask dekslene tre ganger med to milliliter PBS.For immunstaining, tilsett to milliliter blokkeringsbuffer til hver brønn. Etter en time inkubasjon, tilsett 100 mikroliter primær antistoffløsning til hver dekslelip. Bruk pinsett til å dekke dekslene med firkantet parafilm og plasser parafilmen forsiktig for ikke å lage bobler.Dekk deretter platen i aluminiumsfolie og inkuber det primære antistoffet over natten ved fire grader Celsius i et fuktet kammer. Påfølgende dag, fjern parafilm firkanter og vask dekslene tre ganger med to milliliter PBS. Etter vasken, tilsett 100 mikroliter sekundær antistoffoppløsning på hver dekslelip og dekk dekslene med en firkant av parafilm som vist.Inkuber det sekundære antistoffet ved romtemperatur i en time og beskytt platen mot lys ved hjelp av folie. Vask deretter dekslene tre ganger med to milliliter 1X PBS. For kjernefysisk farging, tilsett to milliliter DAPI-løsning til hver dekslelip og vask dekslene med PBS.Tilsett 10 til 20 mikroliter IF-spesifikt monteringsmedium på mikroskopsklier. Bruk nålen eller fine pinsett for å løfte dekslene fra bunnen av brønnen. Tørk forsiktig av overflødig væske ved å trykke forsiktig på en kant på et papirhåndkle og monter dekslene på mikroskopsklier.For bildeanskaffelse og analyse, importer disse filene til CellProfiler og analyser dem ved hjelp av flekktellingspipeline. Identifiser hovedobjektet for å identifisere foci ved hjelp av innstillingene som er beskrevet i tekstmanuskriptet, og mål intensiteten. Representative bilder av 5-bromo-2-prime-deoxyuridine foci dannelse og spredning celle kjernefysisk antigen farging etter bestråling er vist her.De genererte enkeltstrengede DNA-sporene ble visualisert som distinkte foci. Den identifiserte foci ble deretter kvantifisert og uttrykt som den totale integrerte intensiteten av bromodeksyuridinfargingen i kjernen. Co-farging viste differensiering mellom kortdistanse reseksjon på grunn av ikke-homolog slutt sammenføyning og lang rekkevidde reseksjon av homolog rekombinasjon ved hjelp av en anti-PCNA antistoff for å identifisere celler som går gjennom S-fasen.PCNA er fremtredende i kjernen og når maksimalt uttrykk under S-fasen av cellesyklusen med ganske intens farging. Resultatet i verdier blir deretter plottet som en scatterplot for å diskriminere mellom PCNA positive og PCNA negative kjerner. PCNA-negative resultater fjernes fra datasettet for å muliggjøre BrdU-intensitetsbasert analyse på grunn av det lave BrdU-signalet uavhengig av tilstanden.PCNA negative kjerner har en basal integrert intensitet av BrdU foci av 900 vilkårlige enheter og denne verdien når 1800 AU i PCNA positive kjerner. I siRNA-kontrolltilstanden er den integrerte intensiteten til BrdU foci per kjerne ca. 1500 AU i PCNA positive kjerner. Etter en effektiv nedslag av PARP-1 ved hjelp av en siRNA, ble det observert en betydelig økning i intensiteten av BrdU-foci til ca. 1900 AU.Denne teknikken kan gi viktig innsikt i den første fasen av homolog rekombinasjon, og dermed bidra til å identifisere om et protein er involvert i det første trinnet i reparasjonsveien. Inkubasjonstiden for pre-utvinning buffere må holdes strengt. Overeksponering for disse bufferne vil føre til overdreven celleavløsning og økt bakgrunnssignal.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Måling cellesyklusprogresjon Kinetics med metabolsk Merking og flowcytometrisystemer

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live-Cell Cycle Analysis of<em&gt; Drosophila</em&gt; Vev bruker Attune Acoustic Fokusering cytometer og Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging av Enkelt Engineered RNA transkripsjoner i levende celler ved hjelp Proporsjonellekspansjon bimolekylære Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Diskriminering og karakterisering av heterocellulære populasjoner ved bruk av kvantitative bildebehandlingsteknikker

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...