Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
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Agradecemos a Marie-Christine Caron por um excelente conselho técnico. Este trabalho é apoiado por financiamento do Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. possui uma cadeira de pesquisa nível 1 no Canadá em reparação de DNA e terapêutica do câncer. J.O'S é um estudante de doutorado da FRQS, e S.Y.M é um pós-doutorando da FRQS.

1. Cultura celular, tratamentos e preparação de clipes
NOTA: Todos os revestimentos celulares, transfecções e tratamentos, além da irradiação, devem ocorrer sob uma capa de cultura celular estéril.
<ol><li>Dia 1º<ol>
<li>Em uma placa de 6 poços, coloque uma única mancha de cobertura em cada poço para quantas condições for necessário. Placa ~150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso, conforme desejado. NOTA: Se transfetar, recomenda-se fazer uma tr...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Este artigo descreve um método que faz uso da coloração IF para medir variações na ressecção de DNA no celulose. O padrão atual para observar um efeito na ressecção do DNA é através da coloração de RPA; no entanto, este é um método indireto que pode ser influenciado pela replicação do DNA. Anteriormente, outra técnica de SEC baseada em incorporação de DNA baseada em BrdU foi descrita para classificar as intensidades resultantes em células brdU-positivas e brdU-negativos. Esse método permit...

Modulação de fatores de reparação de DNA é um método em constante evolução para a terapia do câncer, particularmente em ambientes tumorais deficientes de reparação de DNA DSB. A inibição de fatores de reparação específicos é uma das estratégias engenhosas usadas para sensibilizar as células cancerígenas para agentes prejudiciais ao DNA. Décadas de pesquisa levaram à identificação de várias mutações de genes de reparação de DNA como biomarcadores para escolhas de estratégia terapêutica1. Consequentemente, o campo de reparação de DNA tornou-se um centro de desenvolvimento de medicamentos para garantir uma ampla gama de tratamentos, capacitando o conceito de medicina personalizada. 
Os DSBs são reparados por duas vias principais: NHEJ e HR2. A via NHEJ é propensa a erros, ligando rapidamente as duas extremidades de DNA com pouco ou nenhum processamento final de DNA e envolvendo a quinase proteica (DNA-PKcs), o complexo Ku70/80, 53BP1 e RIF1 proteins3. Em contrapartida, o RH é um mecanismo fiel iniciado pelo BRCA14. Um passo essencial na reparação do RH é o processo de ressecção do DNA-end, que é a degradação das extremidades quebradas levando ao DNA de um único fio (ss) com extremidades de 3'-OH. O BRCA1 facilita o recrutamento das proteínas a jusante que formam o resectosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que estão envolvidos na ressecção de DNA de 5' a 3'5. 
A ressecção final inicial é realizada através da atividade endonuclease do MRE11, permitindo um processamento adicional pelos núcleos DNA2 e EXO1. As ssDNA ssDNA geradas são rapidamente revestidas por Proteína de Replicação A (RPA) para protegê-los de mais processamento. Posteriormente, BRCA2, PALB2 e BRCA1 se engajam para mediar o deslocamento do RPA e a montagem do nucleofilamento RAD51 necessário para o mecanismo de reparação direcionado à ímologia. Um bom equilíbrio entre o uso de NHEJ e RH é necessário para a manutenção ideal da integridade genômica. A escolha do caminho depende da fase do ciclo celular. O RH é usado preferencialmente durante as fases S e G2, onde a ressecção de DNA está no mais alto nível, e as cromátides irmãs estão disponíveis para garantir o reparo adequado.
Poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP-1) é uma das primeiras proteínas recrutadas para o DSB. Regula tanto a atividade de ressecção quanto a montagem de efeitos a jusante envolvidos no NHEJ5,6. PARP-1 também é necessário para o reparo de quebra de um único fio de DNA durante a replicação7,8. Devido ao seu importante papel na reparação do DNA, os inibidores PARP (PARPi) são usados como terapias contra o câncer. Em vários cânceres deficientes de RH, o tratamento PARPi leva a uma resposta letal sintética devido à incapacidade das células deficientes de RH para reparar o dano acumulado através de uma via alternativa9,10. Atualmente existem quatro PARPi aprovados pela FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib e Talazoparib (também chamado de BMN 673), que são usados para vários tratamentos de câncer de mama e ovário11. No entanto, a resistência parpi é comum, e uma causa potencial surge através da reaquisição da proficiência em RH12. A perda ou inibição do PARP-1 na presença de irradiação desregula o maquinário resectoso, levando ao acúmulo de tratos SSDNA mais longos13. Portanto, um estudo aprofundado da ressecção de DNA in vivo é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento subsequente de novas estratégias para tratar o câncer e superar a resistência do PARPi.
Existem vários métodos empregados para detectar eventos de ressecção de DNA5. Um desses métodos é a técnica clássica baseada em IF que permite a coloração indireta e visualização do DNA ressecado após dSB induzido pelo estresse usando um anticorpo anti-RPA. Rotular DNA genômico com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU) e detectar apenas ssDNA é uma medição direta de eventos de ressecção de DNA. Contorna o monitoramento do RPA, que está envolvido em múltiplos processos celulares, como a replicação de DNA. No método descrito aqui, as células incubadas com BrdU para um único ciclo celular permitem que BrdU seja incorporada em um fio do DNA celular replicante. Após a ressecção, a coloração if é realizada em condições que permitem a detecção de BrdU apenas na forma ssDNA, com o uso de um anticorpo anti-BrdU. Este anticorpo só pode acessar nucleotídeos brdu expostos e não detectará aqueles integrados em DNA de dupla cadeia. Utilizando microscopia de fluorescência, o DNA ressecado pode ser visualizado na forma de focos de BrdU/ssDNA pontuados. A intensidade nuclear desses focos pode ser usada como leitura para quantificar a ressecção após danos no DNA. Este artigo descreve passo a passo os processos deste método, que podem ser aplicados à maioria das linhas celulares de mamíferos. Este método deve ser de ampla utilidade como uma forma simples de monitorar a ressecção final do DNA no celulose, como prova de conceito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

O estudo da resposta a danos no DNA (DDR) é um campo complexo e essencial, que só se tornou mais importante devido ao uso de medicamentos direcionados ao DDR para o tratamento do câncer. Estes alvos são poli (ADP-ribose) polimerases (PARPs), que iniciam várias formas de reparação de DNA. Inibir essas enzimas utilizando inibidores parp (PARPi) atinge a letalidade sintética conferindo uma vulnerabilidade terapêutica em células deficientes de recombinação homólogo (RH) devido a mutações no câncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2 ou parceiro e localizador do BRCA2 (PALB2). 
As células tratadas com PARPi acumulam quebras de duplo fio de DNA (DSBs). Essas quebras são processadas pelo maquinário de ressecção final de DNA, levando à formação de DNA mono-encalhado (ss) e posterior reparação de DNA. Em um contexto deficiente brca1, revigorar a ressecção do DNA através de mutações em inibidores de ressecção de DNA, como 53BP1 e DYNLL1, causa resistência parpi. Portanto, ser capaz de monitorar a ressecção de DNA em celulose é fundamental para uma compreensão mais clara das vias de reparação de DNA e o desenvolvimento de novas estratégias para superar a resistência do PARPi. As técnicas baseadas em imunofluorescência (IF) permitem o monitoramento da ressecção global de DNA após danos no DNA. Esta estratégia requer rotulagem de DNA genômico de pulso longo com 5-bromo-2′-desoxyuridina (BrdU). Após danos no DNA e ressecção da extremidade do DNA, o DNA de uma única cadeia resultante é especificamente detectado por um anticorpo anti-BrdU em condições nativas. Além disso, a ressecção de DNA também pode ser estudada usando marcadores de ciclo celular para diferenciar entre várias fases do ciclo celular. As células da fase S/G2 permitem o estudo da ressecção final dentro do RH, enquanto as células G1 podem ser usadas para estudar a junção final não homólogo (NHEJ). Um protocolo detalhado para este método IF acoplado à discriminação do ciclo celular é descrito neste artigo.

Neste protocolo, o ensaio baseado em bromodeoxyuridina (BrdU) foi usado para medir quantitativamente a resposta de ressecção das células HeLa para danos induzidos por irradiação. As faixas de SSDNA geradas são visualizadas como focos distintos após a coloração da imunofluorescência (Figura 1A). Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração da BRDU nos núcleos (Figura 1B, Figura ...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Este protocolo permite na quantificação de celulose do DNA e ressecção após danos no DNA. A principal vantagem desta técnica é a marcação do ciclo celular que restringe as células à fase S e G2, garantindo que o sinal de bromodeoxyuridina resulte do DNA e da ressecção. Demonstrando o procedimento estarão Jean-Yves Masson, um dos principais investigadores, e Sofiane Y.Mersaoui, pesquisadora de pós-doutorado.Trabalhando sob um capô de cultura estéril, coloque uma única mancha em cada poço de uma placa de seis poços para quantas condições necessárias. Placa aproximadamente 150.000 células HeLa para transfecção ou tratamento medicamentoso. No terceiro dia, após a incubação noturna com BrdU em uma concentração final de 10 micromolar, irradie as placas com uma dose total de cinco cinzas de irradiação de raios-X.Após a irradiação, devolva as placas para incubação a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de óxido de carbono de 5% por três horas. Para pré-extração, aspire o meio e lave cuidadosamente as células duas vezes com PBS. Depois de remover o PBS, adicione dois mililitros de tampão de pré-extração A e incuba as células a quatro graus Celsius no gelo por 10 minutos.Após 10 minutos, aspire tampão A, adicione dois mililitros de citoesqueleto descascando tampão B, e repita a incubação. Em seguida, aspire cuidadosamente o tampão B e lave as células com PBS. Após aspirar PBS, fixe as células adicionando dois mililitros de 4% de paraformaldeído sob a capa química.Após a remoção do paraformaldeído e lava com PBS, cubra as tampas com metanol 100% frio para incubação a menos 20 graus Celsius por cinco minutos e lave as tampas duas vezes com PBS. Para permeabilização, incubar as células com dois mililitros de PBS contendo 0,5% Tritan X-100 à temperatura ambiente. Após 15 minutos, lave as tampas três vezes com dois mililitros de PBS.Para imunostaining, adicione dois mililitros de tampão de bloqueio a cada poço. Após uma hora de incubação, adicione 100 microliters de solução de anticorpos primários a cada deslizamento de cobertura. Use pinças para cobrir as tampas com parafilm quadrado e posicione cuidadosamente o parafilme para não criar bolhas.Em seguida, cubra a placa em papel alumínio e incuba o anticorpo primário durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara umidificada. No dia seguinte, remova as praças de parafilm e lave as tampas três vezes com dois mililitros de PBS. Após a lavagem, adicione 100 microliters de solução de anticorpos secundários em cada tampa e cubra as tampas com um quadrado de parafilm, como demonstrado.Incubar o anticorpo secundário à temperatura ambiente por uma hora e proteger a placa da luz usando papel alumínio. Em seguida, lave as tampas três vezes com dois mililitros de 1X PBS. Para coloração nuclear, adicione dois mililitros de solução DAPI a cada deslizamento de cobertura e lave as tampas com PBS.Adicione 10 a 20 microlitros de meio de montagem específico do IF em slides de microscópio. Use a agulha ou pinça fina para levantar a tampa da parte inferior do poço. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido tocando uma borda suavemente em uma toalha de papel e monte as tampas em slides de microscópio.Para aquisição e análise de imagens, importe esses arquivos para o CellProfiler e analise-os usando o pipeline de contagem de manchas. Identifique o objeto principal para identificar os focos usando as configurações descritas no manuscrito do texto e medir a intensidade. Imagens representativas da formação de focos de desoxyuridina 5-bromo-2-prime-desoxyuridina e a proliferação de manchas de antígeno nuclear celular após a irradiação são mostradas aqui.As faixas de DNA geradas foram visualizadas como focos distintos. Os focos identificados foram então quantificados e expressos como a intensidade total integrada da coloração bromodeoxyuridina nos núcleos. A co-coloração mostrou diferenciação entre a ressecção de curto alcance devido à junção final não homólogoa e a ressecção de longo alcance da recombinação homóloga usando um anticorpo anti-PCNA para identificar células que passam pela fase S.O PCNA é proeminente no núcleo e atinge a expressão máxima durante a fase S do ciclo celular com uma coloração bastante intensa. O resultado em valores são então plotados como uma estratégia de dispersão para discriminar entre os núcleos negativos PCNA positivo e PCNA. Os resultados negativos do PCNA são removidos do conjunto de dados para permitir a análise baseada em intensidade de BrdU devido ao sinal de BrdU baixo, independentemente da condição.Os núcleos negativos do PCNA abrigam uma intensidade basal integrada de focos brdU de 900 unidades arbitrárias e esse valor chega a 1.800 UA em núcleos positivos pcna. Na condição de controle do siRNA, a intensidade integrada de focos de BrdU por núcleo é de aproximadamente 1.500 UA nos núcleos positivos do PCNA. Após um knockdown eficiente de PARP-1 utilizando um siRNA, observou-se um aumento significativo na intensidade dos focos brdU para aproximadamente 1.900 UA.Esta técnica pode fornecer insights-chave sobre o primeiro estágio da recombinação homólogo, ajudando assim a identificar se uma proteína está envolvida no primeiro passo da via de reparo. O tempo de incubação dos buffers de pré-extração deve ser estritamente mantido. A exposição excessiva a esses buffers resultará em descolamento excessivo de células e aumento do sinal de fundo.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Rotulagem e hESCs hMSCs com óxido de ferro nanopartículas para Não-invasiva em Rastreamento vivo com ressonância magnética

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...