Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Мы благодарим Мари-Кристин Карон за выдающиеся технические консультации. Эта работа поддерживается финансированием Канадского института исследований в области здравоохранения J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. занимает исследовательскую кафедру Tier 1 Canada в области репарации ДНК и терапии рака. J.O'S является аспирантом FRQS, а S.Y.M является постдокторантом FRQS.

1. Клеточная культура, обработка и подготовка покровов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все клеточные покрытия, трансфекции и обработки, кроме облучения, должны проходить под стерильным капюшоном клеточной культуры.
<ol><li>День 1<ol>
<li>В 6-луночной пластине поместите один крышку в каждую скважин...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

В этой статье описывается метод, который использует окрашивание ПЧ для измерения вариаций резекции ДНК в целлюлозе. В настоящее время стандартом для наблюдения за влиянием на резекцию ДНК является окрашивание RPA; однако это косвенный метод, на который может влиять репликация ДНК. ?...

Модуляция факторов репарации ДНК является постоянно развивающимся методом терапии рака, особенно в опухолевых средах с дефицитом репарации ДНК DSB. Ингибирование специфических факторов репарации является одной из гениальных стратегий, используемых для сенсибилизации раковых клеток к агентам, повреждающим ДНК. Десятилетия исследований привели к выявлению различных мутаций генов репарации ДНК в качестве биомаркеров для выбора терапевтической стратегии1. Следовательно, область репарации ДНК стала центром разработки лекарств для обеспечения широкого спектра методов лечения, расширяя возможности концепции персонализированной медицины. 
DSB ремонтируются двумя основными путями: NHEJ и HR2. Путь NHEJ подвержен ошибкам, быстро перевязывая два конца ДНК практически без конечной обработки ДНК и включая протеинкиназу (ДНК-PKcs), комплекс Ku70/80, белки 53BP1 и RIF13. Напротив, HR является верным механизмом, инициированным BRCA14. Важным шагом в восстановлении HR является процесс резекции конца ДНК, который представляет собой деградацию сломанных концов, приводящую к одноцепочечной (ss) ДНК с концами 3'-OH. BRCA1 облегчает набор нисходящих белков, которые образуют резектосому MRN / RPA / BLM / DNA2 / EXO1, которые участвуют в резекции ДНК от 5' до 3'5. 
Начальная конечная резекция осуществляется через эндонуклеазную активность MRE11, что позволяет проводить дальнейшую обработку нуклеазами DNA2 и EXO1. Генерируемые свесы ssDNA быстро покрываются репликационным белком A (RPA), чтобы защитить их от дальнейшей обработки. Впоследствии BRCA2, PALB2 и BRCA1 участвуют в опосредовании смещения RPA и сборки нуклеофиламента RAD51, необходимого для механизма репарации, направленного на гомологию. Тонкий баланс между использованием NHEJ и HR необходим для оптимального поддержания геномной целостности. Выбор пути зависит от фазы клеточного цикла. HR предпочтительно используется во время фаз от S до G2, где резекция ДНК находится на самом высоком уровне, а сестринские хроматиды доступны для обеспечения надлежащего восстановления.
Поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP-1) является одним из самых ранних белков, рекрутированных в DSB. Он регулирует как резекционную активность, так и сборку последующих эффекторов, участвующих в NHEJ5,6. PARP-1 также необходим для восстановления одноцепочечного разрыва ДНК во время репликации7,8. Благодаря своей важной роли в восстановлении ДНК, ингибиторы PARP (PARPi) используются в качестве терапии рака. При нескольких раковых заболеваниях с дефицитом HR лечение PARPi приводит к синтетическому летальному ответу из-за неспособности клеток с дефицитом HR восстанавливать накопленный ущерб с помощью альтернативного пути9,10. В настоящее время существует четыре одобренных FDA PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib и Talazoparib (также называемый BMN 673), которые используются для различных методов лечения рака молочной железы и яичников11. Тем не менее, устойчивость к PARPi распространена, и одна потенциальная причина возникает в результате повторного приобретения навыков HR12. Потеря или ингибирование PARP-1 в присутствии облучения дисрегулирует механизм резектосомы, что приводит к накоплению более длинных трактов сдНК13. Поэтому углубленное изучение резекции ДНК in vivo имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и последующей разработки новых стратегий лечения рака и преодоления резистентности к PARPi.
Существует несколько методов, используемых для обнаружения событий резекции ДНК5. Одним из таких методов является классический метод на основе ПЧ, позволяющий косвенно окрашивать и визуализировать резецированную ДНК после вызванного стрессом DSB с использованием антитела против RPA. Маркировка геномной ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU) и обнаружение только ssDNA является прямым измерением событий резекции ДНК. Он обходит мониторинг RPA, который участвует в нескольких клеточных процессах, таких как репликация ДНК. В способе, описанном здесь, клетки, инкубированные с BrdU в течение одного клеточного цикла, позволяют BrdU быть включенным в одну цепь реплицирующейся клеточной ДНК. После резекции окрашивание ПЧ проводят в условиях, допускающих обнаружение BrdU только в форме ssDNA, с использованием антитела против BrdU. Это антитело может получить доступ только к воздействию нуклеотидов BrdU и не будет обнаруживать те, которые интегрированы в двухцепочечную ДНК. С помощью флуоресцентной микроскопии резецированную ДНК можно визуализировать в виде пунктатных очагов BrdU/ssDNA. Ядерная интенсивность этих очагов может быть использована в качестве считывания для количественной оценки резекции после повреждения ДНК. В данной работе описаны пошаговые процессы данного метода, которые могут быть применены к большинству клеточных линий млекопитающих. Этот метод должен иметь широкую полезность как простой способ мониторинга резекции конца ДНК в целлюле, как доказательство концепции.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

Изучение реакции на повреждение ДНК (DDR) является сложной и важной областью, которая стала только более важной из-за использования препаратов, нацеленных на DDR, для лечения рака. Этими мишенями являются поли(АДФ-рибоза) полимеразы (PARPs), которые инициируют различные формы репарации ДНК. Ингибирование этих ферментов с использованием ингибиторов PARP (PARPi) достигает синтетической летальности, придавая терапевтическую уязвимость гомологичным рекомбинационным (HR)-дефицитным клеткам из-за мутаций в раке молочной железы типа 1 (BRCA1), BRCA2 или партнере и локализаторе BRCA2 (PALB2). 
Клетки, обработанные PARPi, накапливают двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Эти разрывы обрабатываются механизмом резекции конца ДНК, что приводит к образованию одноцепочечной (ss) ДНК и последующему восстановлению ДНК. В контексте дефицита BRCA1 оживление резекции ДНК посредством мутаций в ингибиторах резекции ДНК, таких как 53BP1 и DYNLL1, вызывает резистентность к PARPi. Поэтому возможность мониторинга резекции ДНК в целлюлозе имеет решающее значение для более четкого понимания путей репарации ДНК и разработки новых стратегий преодоления резистентности к PARPi. Методы, основанные на иммунофлуоресценции (IF), позволяют контролировать глобальную резекцию ДНК после повреждения ДНК. Эта стратегия требует длинноимпульсной геномной маркировки ДНК 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU). После повреждения ДНК и резекции конца ДНК полученная одноцепочечная ДНК специфически обнаруживается анти-BrdU антителом в нативных условиях. Кроме того, резекция ДНК также может быть изучена с использованием маркеров клеточного цикла для дифференциации между различными фазами клеточного цикла. Клетки в фазе S/G2 позволяют изучать конечную резекцию в HR, тогда как клетки G1 могут быть использованы для изучения негомологичного конечного соединения (NHEJ). Подробный протокол для этого метода ПЧ в сочетании с дискриминацией клеточного цикла описан в этой статье.

В этом протоколе анализ на основе бромодезоксиуридина (BrdU) использовался для количественного измерения резекционной реакции клеток HeLa на повреждение, вызванное облучением. Генерируемые следы ssDNA визуализируются как отдельные очаги после иммунофлуоресцентного окрашивания (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

В настоящем протоколе мы демонстрируем, как визуализировать двухцепочечную концевую резекцию ДНК во время фазы S/G2 клеточного цикла с использованием метода, основанного на иммунофлуоресценции.

Оценка глобальной двухцепочечной конечной резекции ДНК с использованием маркировки BrdU-ДНК в сочетании с визуализацией дискриминации клеточного цикла

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Этот протокол позволяет проводить в целлюло количественную оценку ДНК и резекцию после повреждения ДНК. Основным преимуществом этого метода является маркировка клеточного цикла, которая ограничивает клетки фазами S и G2, обеспечивая результаты сигнала бромодезоксиуридина из ДНК и резекции. Продемонстрировать процедуру будут Жан-Ив Массон, главный исследователь, и Софиан Я. Мерсауи, постдокторант.Работая под стерильным культурным капюшоном, поместите один крышку в каждую скважину из шестилуночной пластины для любого необходимого количества условий. Пластина приблизительно 150 000 клеток HeLa для трансфекции или медикаментозного лечения. На третий день, после ночной инкубации с BrdU в конечной концентрации 10 микромоляров, облучают пластины общей дозой пяти серых рентгеновских облучений.После облучения верните пластины для инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ный увлажненный инкубатор оксида углерода в течение трех часов. Для предварительной экстракции аспирируйте среду и тщательно промывайте клетки дважды PBS. После удаления PBS добавьте два миллилитра предварительно экстракционного буфера A и инкубируйте клетки при четырех градусах Цельсия на льду в течение 10 минут.Через 10 минут аспирируют буфер А, добавляют два миллилитра цитоскелета, зачищающего буфер В, и повторяют инкубацию. Затем осторожно аспирируйте буфер B и промывайте клетки PBS. После аспирации PBS зафиксируйте клетки, добавив два миллилитра 4% параформальдегида под химический капот.После удаления параформальдегида и промывки PBS накройте крышки 100% холодным метанолом для инкубации при минус 20 градусах Цельсия в течение пяти минут и дважды промойте крышки PBS. Для пермеабилизации инкубируют клетки двумя миллилитрами PBS, содержащими 0,5% тритана X-100 при комнатной температуре. Через 15 минут трижды вымойте крышки двумя миллилитрами PBS.Для иммуноокрашения добавьте в каждую лунку по два миллилитра блокирующего буфера. После одного часа инкубации добавляйте 100 микролитров раствора первичного антитела к каждому покровному листу. Используйте пинцет, чтобы покрыть крышки квадратным парапленком и аккуратно расположить парапленку, чтобы не создавать пузырьков.Затем накройте пластину алюминиевой фольгой и инкубируйте первичное антитело в течение ночи при четырех градусах Цельсия в увлажненной камере. На следующий день снимите квадраты парапленки и трижды промойте крышки двумя миллилитрами PBS. После промывки добавьте 100 микролитров раствора вторичного антитела на каждый покровный лист и покройте крышки квадратом парапленки, как показано на рисунке.Инкубируют вторичное антитело при комнатной температуре в течение одного часа и защищают пластину от света с помощью фольги. Затем трижды вымойте крышки двумя миллилитрами 1X PBS. Для ядерного окрашивания добавьте два миллилитра раствора DAPI в каждый обшивочный лист и промойте крышки PBS.Добавьте от 10 до 20 микролитров специфичной для ПЧ монтажной среды на предметные стекла микроскопа. Используйте иглу или тонкий пинцет, чтобы поднять крышку со дна колодца. Осторожно смойте лишнюю жидкость, осторожно постучав одним краем по бумажному полотенцу, и установите обшивки на предметные стекла микроскопа.Для получения и анализа изображений импортируйте эти файлы в CellProfiler и проанализируйте их с помощью конвейера подсчета пятен. Определите первичный объект для идентификации очагов с помощью настроек, описанных в текстовой рукописи, и измерьте интенсивность. Здесь показаны репрезентативные изображения образования 5-бром-2-прайм-дезоксиуридиновых очагов и окрашивания клеточного ядерного антигена после облучения.Сгенерированные одноцепочечные дорожки ДНК были визуализированы как отдельные очаги. Затем идентифицированные очаги количественно оценивали и выражали как общую интегральную интенсивность окрашивания бромодеоксиуридина в ядрах. Совместное окрашивание показало дифференциацию между резекцией короткого диапазона из-за негомологичного соединения конца и длинной резекцией гомологичной рекомбинации с использованием антитела против PCNA для идентификации клеток, проходящих через S-фазу.PCNA занимает видное место в ядре и достигает максимальной экспрессии во время S-фазы клеточного цикла с довольно интенсивным окрашиванием. Результат в значениях затем строится в виде диаграммы рассеяния для различения положительных и отрицательных ядер PCNA. Отрицательные результаты PCNA удаляются из набора данных, чтобы обеспечить анализ на основе интенсивности BrdU из-за низкого сигнала BrdU независимо от состояния.Отрицательные ядра PCNA имеют базальную интегральную интенсивность очагов BrdU 900 произвольных единиц, и это значение достигает 1 800 AU в положительных ядрах PCNA. В состоянии контроля siRNA интегральная интенсивность очагов BrdU на ядро составляет приблизительно 1 500 а.е. в положительных ядрах PCNA. После эффективного нокдауна PARP-1 с использованием siRNA наблюдалось значительное увеличение интенсивности очагов BrdU примерно до 1 900 а.е.Этот метод может дать ключевое представление о первой стадии гомологичной рекомбинации, тем самым помогая определить, участвует ли белок в первой стадии пути восстановления. Инкубационное время для буферов предварительной экстракции должно строго соблюдаться. Чрезмерное воздействие этих буферов приведет к чрезмерному отсоединению клеток и увеличению фонового сигнала.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Маркировка ЭСК и hMSCs с Оксид железа наночастиц для неинвазивного в естественных условиях слежения с МРТ

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Маркировка стволовых клеток с флуоресцентными красителями для неинвазивного обнаружения оптических изображений с

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Анализ ДНК двухцепочечной Break (DSB) Ремонт в клетках млекопитающих

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Измерительная ячейка Кинетика цикла прогрессии с метаболическим Маркировка и проточной цитометрии

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Жить анализ клеточного цикла<em&gt; Drosophila</em&gt; Тканей с использованием акустической Attune Фокусировка Цитометр и Vybrant DyeCycle Фиолетовое пятно ДНК

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Дискриминация и характеристика гетеросекулярных групп населения с использованием методов количественной визуализации

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...