Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
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Agradecemos a Marie-Christine Caron por su excelente asesoramiento técnico. Este trabajo está respaldado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. tiene una Cátedra de Investigación de Nivel 1 de Canadá en Reparación del ADN y Terapéutica del Cáncer. J.O'S es un becario de doctorado de FRQS, y S.Y.M es un becario postdoctoral de FRQS.

1. Cultivo celular, tratamientos y preparación de hojas de cubierta
NOTA: Todos los recubrimientos celulares, transfecciones y tratamientos, aparte de la irradiación, deben realizarse bajo una campana de cultivo celular estéril.
<ol><li>Día 1<ol>
<li>En una placa de 6 pocillos, coloque una sola cubierta en cada pozo para tantas condiciones como sea necesario. Placa ~ 150,000 células HeLa para transfección o tratamiento farmacológico, según se desee. NOTA: Si es transfectante, se r...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Este artículo describe un método que hace uso de la tinción IF para medir las variaciones en la resección del ADN en el celulo. El estándar actual para observar un efecto sobre la resección del ADN es a través de la tinción RPA; sin embargo, este es un método indirecto que puede estar influenciado por la replicación del ADN. Anteriormente, se ha descrito otra técnica de RESECCIÓN DE ADN basada en la incorporación de BrdU para clasificar las intensidades resultantes en células BrdU positivas y BrdU ...

La modulación de los factores de reparación del ADN es un método en constante evolución para la terapia del cáncer, particularmente en entornos tumorales deficientes en la reparación del DSB de ADN. La inhibición de factores de reparación específicos es una de las ingeniosas estrategias utilizadas para sensibilizar a las células cancerosas a agentes dañinos para el ADN. Décadas de investigación condujeron a la identificación de varias mutaciones de genes de reparación del ADN como biomarcadores para las opciones de estrategia terapéutica1. En consecuencia, el campo de la reparación del ADN se ha convertido en un centro para el desarrollo de fármacos para garantizar una amplia gama de tratamientos, potenciando el concepto de medicina personalizada. 
Los DSB son reparados por dos vías principales: NHEJ y HR2. La vía NHEJ es propensa a errores, ligando rápidamente los dos extremos de ADN con poco o ningún procesamiento final de ADN e involucrando la proteína quinasa (DNA-PKCs), el complejo Ku70/80, 53BP1 y las proteínas RIF13. En contraste, la RRHH es un mecanismo fiel iniciado por BRCA14. Un paso esencial en la reparación de HR es el proceso de resección del extremo del ADN, que es la degradación de los extremos rotos que conduce a ADN monocatenario (ss) con extremos 3'-OH. BRCA1 facilita el reclutamiento de las proteínas aguas abajo que forman el resectosoma MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, que intervienen en la resección del ADN de 5' a 3'5.
La resección final inicial se logra a través de la actividad de endonucleasa de MRE11, lo que permite un procesamiento posterior por parte de las nucleasas DNA2 y EXO1. Los voladizos de ssDNA generados son rápidamente recubiertos por la proteína de replicación A (RPA) para protegerlos de un procesamiento posterior. Posteriormente, BRCA2, PALB2 y BRCA1 se comprometen a mediar en el desplazamiento de RPA y el ensamblaje del nucleofilamento RAD51 requerido para el mecanismo de reparación dirigido por homología. Un equilibrio fino entre el uso de NHEJ y HR es necesario para el mantenimiento óptimo de la integridad genómica. La elección de la vía depende de la fase del ciclo celular. HR se utiliza preferentemente durante las fases S a G2 en las que la resección de ADN está en el nivel más alto, y las cromátidas hermanas están disponibles para garantizar una reparación adecuada.
La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP-1) es una de las primeras proteínas reclutadas para el DSB. Regula tanto la actividad de resección como el ensamblaje de los efectores aguas abajo implicados en el NHEJ5,6. PARP-1 también es necesario para la reparación de roturas monocatenarias de ADN durante la replicación7,8. Debido a su importante papel en la reparación del ADN, los inhibidores de PARP (PARPi) se utilizan como terapias contra el cáncer. En varios cánceres con deficiencia de FC, el tratamiento con PARPi conduce a una respuesta letal sintética debido a la incapacidad de las células deficientes en HR para reparar el daño acumulado a través de una vía alternativa9,10. Actualmente hay cuatro PARPi aprobados por la FDA: Olaparib, Rucaparib, Niriparib y Talazoparib (también llamado BMN 673), que se utilizan para diversos tratamientos contra el cáncer de mama y ovario11. Sin embargo, la resistencia a PARPi es común, y una causa potencial surge a través de la readquisición de la competencia en RRHH12. La pérdida o inhibición de PARP-1 en presencia de irradiación desregula la maquinaria del resectosoma, lo que lleva a la acumulación de tractos ssDNA más largos13. Por lo tanto, un estudio en profundidad de la resección del ADN in vivo es fundamental para una comprensión más clara de las vías de reparación del ADN y el posterior desarrollo de nuevas estrategias para tratar el cáncer y superar la resistencia a PARPi.
Se han empleado varios métodos para detectar eventos de resección de ADN5. Uno de estos métodos es la técnica clásica basada en IF que permite la tinción indirecta y la visualización del ADN resecado después de un DSB inducido por estrés mediante el uso de un anticuerpo anti-RPA. Etiquetar el ADN genómico con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) y detectar solo ssDNA es una medida directa de los eventos de resección del ADN. Elude el monitoreo de RPA, que está involucrado en múltiples procesos celulares como la replicación del ADN. En el método descrito aquí, las células incubadas con BrdU para un solo ciclo celular permiten que BrdU se incorpore a una hebra del ADN celular replicante. Después de la resección, la tinción de IF se realiza en condiciones que permiten la detección de BrdU solo en forma de ssDNA, con el uso de un anticuerpo anti-BrdU. Este anticuerpo solo puede acceder a los nucleótidos brdU expuestos y no detectará los integrados en el ADN de doble cadena. Utilizando microscopía de fluorescencia, el ADN resecado se puede visualizar en forma de focos de BrdU/ssDNA punteados. La intensidad nuclear de estos focos se puede utilizar como una lectura para cuantificar la resección después del daño en el ADN. Este artículo describe paso a paso los procesos de este método, que se puede aplicar a la mayoría de las líneas celulares de mamíferos. Este método debe ser de amplia utilidad como una forma simple de monitorear la resección final del ADN en el celulo, como prueba de concepto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

El estudio de la respuesta al daño del ADN (DDR) es un campo complejo y esencial, que solo se ha vuelto más importante debido al uso de medicamentos dirigidos a DDR para el tratamiento del cáncer. Estos objetivos son las poli(ADP-ribosa) polimerasas (PARP), que inician diversas formas de reparación del ADN. La inhibición de estas enzimas utilizando inhibidores de PARP (PARPi) logra una letalidad sintética al conferir una vulnerabilidad terapéutica en células deficientes en recombinación homóloga (HR) debido a mutaciones en cáncer de mama tipo 1 (BRCA1), BRCA2, o pareja y localizador de BRCA2 (PALB2). 
Las células tratadas con PARPi acumulan roturas de doble cadena de ADN (DSB). Estas roturas son procesadas por la maquinaria de resección final del ADN, lo que lleva a la formación de ADN monocatenario (ss) y la posterior reparación del ADN. En un contexto deficiente en BRCA1, la revitalización de la resección del ADN a través de mutaciones en los inhibidores de la resección del ADN, como 53BP1 y DYNLL1, causa resistencia a PARPi. Por lo tanto, ser capaz de monitorear la resección del ADN en el celulo es fundamental para una comprensión más clara de las vías de reparación del ADN y el desarrollo de nuevas estrategias para superar la resistencia a PARPi. Las técnicas basadas en la inmunofluorescencia (IF) permiten monitorear la resección global del ADN después del daño del ADN. Esta estrategia requiere el etiquetado de ADN genómico de pulso largo con 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU). Después del daño del ADN y la resección final del ADN, el ADN monocatenario resultante es detectado específicamente por un anticuerpo anti-BrdU en condiciones nativas. Además, la resección del ADN también se puede estudiar utilizando marcadores del ciclo celular para diferenciar entre varias fases del ciclo celular. Las células en la fase S/G2 permiten el estudio de la resección final dentro de HR, mientras que las células G1 se pueden utilizar para estudiar la unión final no homóloga (NHEJ). En este documento se describe un protocolo detallado para este método IF acoplado a la discriminación del ciclo celular.

En este protocolo, se utilizó el ensayo basado en bromodeoxiuridina (BrdU) para medir cuantitativamente la respuesta de resección de las células HeLa al daño inducido por la irradiación. Las pistas de ssDNA generadas se visualizan como focos distintos después de la tinción por inmunofluorescencia (Figura 1A). Los focos identificados se cuantificaron y expresaron como la intensidad total integrada de la tinción de BrdU en los núcleos (Figura 1B, ...

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Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

En el presente protocolo, demostramos cómo visualizar la resección final de doble cadena de ADN durante la fase S / G2 del ciclo celular utilizando un método basado en inmunofluorescencia.

Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Este protocolo permite la cuantificación del ADN y la resección del ADN después del daño del ADN. La principal ventaja de esta técnica es el marcado del ciclo celular que restringe las células a las fases S y G2, asegurando que la señal de bromodeoxiuridina resulte del ADN y la resección. La demostración del procedimiento estará a cargo de Jean-Yves Masson, investigador principal, y Sofiane Y.Mersaoui, investigador postdoctoral.Trabajando bajo una campana de cultivo estéril, coloque una sola cubierta en cada pozo de una placa de seis pocillos para tantas condiciones como sea necesario. Placa de aproximadamente 150, 000 células HeLa para transfección o tratamiento farmacológico. En el tercer día, después de la incubación nocturna con BrdU a una concentración final de 10 micromolares, irradie las placas con una dosis total de cinco grises de irradiación de rayos X.Después de la irradiación, devuelva las placas para la incubación a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con óxido de carbono al 5% durante tres horas. Para la preextracción, aspire el medio y lave cuidadosamente las células dos veces con PBS. Después de eliminar el PBS, agregue dos mililitros de tampón A previo a la extracción e incube las células a cuatro grados Celsius en hielo durante 10 minutos.Después de 10 minutos, aspire el tampón A, agregue dos mililitros de tampón B de extracción de citoesqueleto y repita la incubación. Luego aspire cuidadosamente el tampón B y lave las células con PBS. Después de aspirar PBS, fije las células agregando dos mililitros de 4% de paraformaldehído debajo de la capucha química.Después de la eliminación del paraformaldehído y los lavados con PBS, cubra los cubrecolchas con metanol 100% frío para la incubación a menos 20 grados centígrados durante cinco minutos y lave los cubrehojas dos veces con PBS. Para la permeabilización, incubar las células con dos mililitros de PBS que contengan 0,5% tritan X-100 a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, lave las fundas tres veces con dos mililitros de PBS.Para la inmunotinción, agregue dos mililitros de tampón de bloqueo a cada pozo. Después de una hora de incubación, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios a cada cubierta. Use pinzas para cubrir las cubiertas con parafilm cuadrado y coloque cuidadosamente la parafilm para no crear burbujas.Luego cubra la placa con papel de aluminio e incube el anticuerpo primario durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada. Al día siguiente, retire los cuadrados de la parapelícula y lave las fundas tres veces con dos mililitros de PBS. Después del lavado, agregue 100 microlitros de solución de anticuerpos secundarios en cada funda y cubra las cubiertas con un cuadrado de parapelícula como se ha demostrado.Incubar el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora y proteger la placa de la luz con papel de aluminio. Luego lave los cubrehojas tres veces con dos mililitros de 1X PBS. Para la tinción nuclear, agregue dos mililitros de solución DAPI a cada funda y lave las cubiertas con PBS.Agregue de 10 a 20 microlitros de medio de montaje específico de IF en los portaobjetos del microscopio. Use la aguja o pinzas finas para levantar el deslizamiento de la cubierta desde el fondo del pozo. Elimine con cuidado el exceso de líquido golpeando suavemente un borde sobre una toalla de papel y monte las fundas en los portaobjetos del microscopio.Para la adquisición y el análisis de imágenes, importe estos archivos en CellProfiler y analícelos mediante la canalización de conteo de manchas. Identifique el objeto primario para identificar los focos utilizando la configuración descrita en el manuscrito de texto y mida la intensidad. Aquí se muestran imágenes representativas de la formación de focos de 5-bromo-2-prime-desoxiuridina y la proliferación de la tinción de antígenos nucleares celulares después de la irradiación.Las huellas de ADN monocatenario generadas se visualizaron como focos distintos. Los focos identificados se cuantificaron y expresaron como la intensidad total integrada de la tinción de bromodeoxiuridina en los núcleos. La tinción conjunta mostró diferenciación entre la resección de corto alcance debido a la unión final no homóloga y la resección de largo alcance de la recombinación homóloga utilizando un anticuerpo anti-PCNA para identificar las células que pasan por la fase S.El PCNA es prominente en el núcleo y alcanza la máxima expresión durante la fase S del ciclo celular con una tinción bastante intensa. El resultado en valores se traza como un diagrama de dispersión para discriminar entre núcleos PCNA positivos y PCNA negativos. Los resultados negativos de PCNA se eliminan del conjunto de datos para permitir el análisis basado en la intensidad de BrdU debido a la baja señal de BrdU independientemente de la condición.Los núcleos negativos de PCNA albergan una intensidad basal integrada de focos de BrdU de 900 unidades arbitrarias y este valor alcanza 1.800 UA en núcleos positivos de PCNA. En la condición de control de siRNA, la intensidad integrada de los focos de BrdU por núcleo es de aproximadamente 1.500 UA en los núcleos PCNA positivos. Después de un derribo eficiente de PARP-1 utilizando un siRNA, se observó un aumento significativo en la intensidad de los focos de BrdU a aproximadamente 1, 900 UA.Esta técnica puede proporcionar información clave sobre la primera etapa de la recombinación homóloga, ayudando así a identificar si una proteína está involucrada en el primer paso de la vía de reparación. El tiempo de incubación de los tampones previos a la extracción debe mantenerse estrictamente. La sobreexposición a estos búferes dará como resultado un desprendimiento celular excesivo y un aumento de la señal de fondo.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

La medición de la exocitosis en las neuronas de un etiquetado FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Investigación

Biología

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Teléfono directo Análisis de Ciclo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos que usan la acústica Attune Centrándose citómetro y Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Discriminación y Caracterización de las Poblaciones Heterocelulares Usando Técnicas de Imagen Cuantitativa

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...