Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Vi tackar Marie-Christine Caron för enastående teknisk rådgivning. Detta arbete stöds av finansiering från Canadian Institutes of Health Research J.Y.M (CIHR FDN-388879). J.-Y.M. innehar en Tier 1 Canada Research Chair i DNA Repair and Cancer Therapeutics. J.O'S är en FRQS doktorand fellow, och S.Y.M är en FRQS postdoktor.

1. Cellkultur, behandlingar och täckskyddsberedning
OBS: All cellplätering, transfektioner och behandlingar, förutom bestrålning, bör ske under en steril cellodlingshuv.
<ol><li>Dag 1<ol>
<li>Placera ett enda täckglas i varje brunn i en 6-brunnsplatta i varje brunn under så många förhållanden som behövs. Plätera ~150 000 HeLa-celler för transfektion eller läkemedelsbehandling, efter önskemål. OBS: Vid transfecting rekommenderas att göra en omvänd transfekt vid plätering...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Detta dokument beskriver en metod som använder IF färgning för att mäta variationer i DNA samband i cellulo. Den nuvarande standarden för att observera en effekt på DNA-samband är genom RPA-färgning; Detta är dock en indirekt metod som kan påverkas av DNA-replikering. Tidigare har en annan BrdU-införlivande-baserade DNA-samband IF teknik beskrivits för att klassificera de resulterande intensiteterna i BrdU-positiva och BrdU-negativa celler. Denna metod tillät att celler som inte genomgår HR räknas...

Modulering av DNA-reparationsfaktorer är en ständigt utvecklande metod för cancerbehandling, särskilt i DNA DSB reparationsbrist tumörmiljöer. Hämningen av specifika reparationsfaktorer är en av de geniala strategier som används för att sensibilisera cancerceller till DNA-skadliga medel. Årtionden av forskning ledde till identifiering av olika mutationer av DNA-reparationsgener som biomarkörer för terapeutiska strategival1. Följaktligen har DNA-reparationsområdet blivit ett nav för läkemedelsutveckling för att säkerställa ett brett utbud av behandlingar, vilket stärker det personliga medicinkonceptet. 
DSB repareras av två huvudvägar: NHEJ och HR2. NHEJ-vägen är felbenägen, snabbt ligating de två DNA-ändarna med lite eller ingen DNA-slutbehandling och involverar proteinkinas (DNA-PKcs), Ku70/80-komplexet, 53BP1 och RIF1 proteiner3. HR är däremot en trogen mekanism initierad av BRCA14. Ett viktigt steg i HR-reparation är DNA-end-sambandsprocessen, som är nedbrytningen av de trasiga ändarna som leder till enkelsträngat (ss) DNA med 3'-OH-ändar. BRCA1 underlättar rekryteringen av de nedströmsproteiner som utgör det rektosomiska MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1, som är involverade i 5' till 3' DNA-samband5.
Den första end-resection uppnås genom endonukleas aktivitet av MRE11, vilket möjliggör ytterligare bearbetning av DNA2 och EXO1 nukleaser. De genererade ssDNA-överhängen är snabbt belagda av Replication Protein A (RPA) för att skydda dem från ytterligare bearbetning. Därefter engagerar BRCA2, PALB2 och BRCA1 för att medla förskjutningen av RPA och monteringen av RAD51 nukleofilament som krävs för homologi-riktad reparationsmekanism. En fin balans mellan användningen av NHEJ och HR är nödvändig för optimalt upprätthållande av genomisk integritet. Valet av väg beror på cellcykelfasen. HR används företrädesvis under S till G2-faserna där DNA-samband är på högsta nivå och systerkromatiderna finns tillgängliga för att säkerställa korrekt reparation.
Poly (ADP-ribose) polymeras 1 (PARP-1) är ett av de tidigaste proteinerna som rekryteras till DSB. Den reglerar både sambandsaktivitet och montering av nedströmseffektorer som är involverade i NHEJ5,6. PARP-1 krävs också för DNA-enkelsträngad pausreparation under replikering7,8. På grund av dess viktiga roll i DNA-reparation används PARP-hämmare (PARPi) som cancerbehandlingar. I flera HR-bristfälliga cancerformer leder PARPi-behandling till ett syntetiskt dödligt svar på grund av oförmågan hos HR-bristfälliga celler att reparera den ackumulerade skadan via en alternativ väg9,10. Det finns för närvarande fyra FDA-godkända PARPi: Olaparib, Rucaparib, Niriparib och Talazoparib (även kallad BMN 673), som används för olika bröst- och äggstockscancerbehandlingar11. PARPi-resistens är dock vanligt, och en potentiell orsak uppstår genom reacquisition av HR-färdigheter12. Förlust eller hämning av PARP-1 i närvaro av bestrålning dysregulates resectosome maskiner, vilket leder till ackumulering av längre ssDNA skrifter13. Därför är en djupgående studie av DNA-samband in vivo avgörande för en tydligare förståelse av DNA-reparationsvägarna och den efterföljande utvecklingen av nya strategier för att behandla cancer och övervinna PARPi-resistens.
Det har använts flera metoder för att upptäcka DNA-sambandshändelser5. En sådan metod är den klassiska IF-baserade tekniken som möjliggör indirekt färgning och visualisering av det resected DNA efter stress-inducerad DSB med hjälp av en anti-RPA antikropp. Märkning av genomiskt DNA med 5-bromo-2′-deoxyuridin (BrdU) och påvisande av endast ssDNA är ett direkt mått på DNA-sambandshändelser. Det kringgår övervakningen av RPA, som är involverad i flera cellulära processer som DNA-replikering. I den metod som beskrivs här tillåter celler inkuberade med BrdU för en enda cellcykel BrdU att införlivas i en del av replikerande cellulärt DNA. Efter samband utförs IF-färgning under förhållanden där BrdU-detektion endast kan påvisas i ssDNA-form, med användning av en anti-BrdU-antikropp. Denna antikropp kan endast komma åt exponerade BrdU-nukleotider och kommer inte att upptäcka de som är integrerade i dubbelsträngat DNA. Med hjälp av fluorescensmikroskopi kan det vidaredelade DNA visualiseras i form av punktera BrdU/ssDNA-högborgar. Den nukleära intensiteten hos dessa högborgar kan användas som avläsning för att kvantifiera samband efter DNA-skador. Detta dokument beskriver steg för steg processerna för denna metod, som kan tillämpas på de flesta däggdjurs cellinjer. Denna metod bör vara av bred nytta som ett enkelt sätt att övervaka DNA-end samband i cellulo, som ett bevis på koncept.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

Studien av DNA-skaderesponsen (DDR) är ett komplext och viktigt område, som bara har blivit viktigare på grund av användningen av DDR-inriktade läkemedel för cancerbehandling. Dessa mål är poly(ADP-ribose) polymeraser (PARPs), som initierar olika former av DNA-reparation. Att hämma dessa enzymer med PARP-hämmare (PARPi) uppnår syntetisk dödlighet genom att ge en terapeutisk sårbarhet i homolog rekombination (HR) -bristfälliga celler på grund av mutationer i bröstcancer typ 1 (BRCA1), BRCA2 eller partner och lokaliserare av BRCA2 (PALB2). 
Celler som behandlas med PARPi ackumulerar DNA-dubbelsträngsbrytningar (DSB). Dessa brott bearbetas av DNA-ändresektionsmaskineriet, vilket leder till bildandet av enkelsträngat (ss) DNA och efterföljande DNA-reparation. I ett BRCA1-bristfälligt sammanhang orsakar återupplivande DNA-samband genom mutationer i DNA-sambandshämmare, såsom 53BP1 och DYNLL1, PARPi-resistens. Därför är det viktigt att kunna övervaka DNA-samband i cellulosa för en tydligare förståelse av DNA-reparationsvägarna och utvecklingen av nya strategier för att övervinna PARPi-resistens. Immunofluorescensbaserade (IF)-baserade tekniker möjliggör övervakning av global DNA-samband efter DNA-skador. Denna strategi kräver långpuls genomisk DNA-märkning med 5-bromo-2′-deoxyuridin (BrdU). Efter DNA-skador och DNA-end samband detekteras det resulterande enkelsträngade DNA specifikt av en anti-BrdU-antikropp under inhemska förhållanden. Dessutom kan DNA-samband också studeras med hjälp av cellcykelmarkörer för att skilja mellan olika faser av cellcykeln. Celler i S/G2-fasen tillåter studier av end samband inom HR, medan G1-celler kan användas för att studera icke-homolog end joining (NHEJ). Ett detaljerat protokoll för denna IF-metod kopplad till cellcykeldiskriminering beskrivs i detta dokument.

I detta protokoll användes den bromodeoxyuridin -baserade analysen för att kvantitativt mäta sambandssvaret hos HeLa-celler på bestrålningsinducerade skador. De genererade ssDNA spåren visualiseras som distinkta högborgar efter immunofluorescensfärgning (figur 1A). De identifierade foci kvantifierades sedan och uttrycktes som den totala integrerade intensiteten av BrdU-färgningen i kärnorna (figur 1B, kompletterande figur S1, kompletterande fig...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

I det nuvarande protokollet visar vi hur man visualiserar DNA dubbelsträngad end samband under S/G2 fas av cellcykeln med hjälp av en immunofluorescensbaserad metod.

Bedömning av global DNA Double-Strand End Samband med BrdU-DNA-märkning i kombination med cellcykeldiskrimineringsavbildning

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Detta protokoll möjliggör i cellulo kvantifiering av DNA och samband efter DNA-skador. Denna tekniks främsta fördel är cellcykelmärkningen som begränsar cellerna till S- och G2-fas, vilket säkerställer att bromodeoxyuridinsignalen är resultatet av DNA och samband. Programmet kommer att demonstreras av Jean-Yves Masson, huvudprövare, och Sofiane Y.Mersaoui, postdoktor.Arbeta under en steril kulturhuva, placera ett enda täckslip i varje brunn på en sexbrunnstallrik för så många förhållanden som behövs. Plätera cirka 150 000 HeLa-celler för transfektion eller läkemedelsbehandling. På dag tre, efter inkubation över natten med BrdU vid en slutlig koncentration av 10 mikromolar, bestråla plattorna med en total dos av fem grå röntgenbestrålning.Efter bestrålning, returnera plattorna för inkubation vid 37 grader Celsius i en 5% koloxid fuktad inkubator i tre timmar. För förutvinning, aspirera mediet och tvätta försiktigt cellerna två gånger med PBS. Efter att ha tagit bort PBS, tillsätt två milliliter för extraktionsbuffert A och inkubera cellerna vid fyra grader Celsius på is i 10 minuter.Efter 10 minuter, aspirate buffert A, tillsätt två milliliter cytoskeleton strippning buffert B och upprepa inkubationen. Aspirera sedan försiktigt buffert B och tvätta cellerna med PBS. Efter inandning av PBS, fixera cellerna genom att tillsätta två milliliter av 4% paraformaldehyd under den kemiska huven.Efter avlägsnande av paraformaldehyd och tvättar med PBS, täck täckbladen med 100% kall metanol för inkubation vid minus 20 grader Celsius i fem minuter och tvätta täcksläpningarna två gånger med PBS. För permeabilisering, inkubera cellerna med två milliliter PBS som innehåller 0,5% Tritan X-100 vid rumstemperatur. Tvätta täckena tre gånger efter 15 minuter med två milliliter PBS.För immunstaining, tillsätt två milliliter blockeringsbuffert till varje brunn. Efter en timmes inkubation tillsätt 100 mikroliter primär antikroppslösning till varje täckslip. Använd pincett för att täcka täckena med fyrkantig parafilm och placera försiktigt parafilmen för att inte skapa bubblor.Täck sedan plattan i aluminiumfolie och inkubera den primära antikroppen över natten vid fyra grader Celsius i en fuktad kammare. På följande dag tar du bort parafilmrutorna och tvättar täcksläparna tre gånger med två milliliter PBS. Efter tvätten tillsätt 100 mikroliter sekundär antikroppslösning på varje täckslip och täck täck täcksliparna med en kvadrat av parafilm som visats.Inkubera den sekundära antikroppen vid rumstemperatur i en timme och skydda plattan från ljus med hjälp av folie. Tvätta sedan täcksläparna tre gånger med två milliliter 1X PBS. För nukleär färgning, tillsätt två milliliter DAPI-lösning till varje täckslip och tvätta täcksliparna med PBS.Tillsätt 10 till 20 mikroliter IF-specifikt monteringsmedium på mikroskopbilder. Använd nålen eller fina pincett för att lyfta täcksläckat från botten av brunnen. Torka försiktigt av överflödig vätska genom att knacka försiktigt på en kant på en pappershandduk och montera täckverktygen på mikroskopglas.För bildförvärv och analys importerar du dessa filer till CellProfiler och analyserar dem med hjälp av speckle counting-pipelinen. Identifiera det primära objektet för att identifiera foci med hjälp av de inställningar som beskrivs i textmanuskriptet och mäta intensiteten. Representativa bilder av 5-bromo-2-prime-deoxyuridin foci bildandet och prolifering cell nukleära antigen färgning efter bestrålning visas här.De genererade enkelsträngade DNA-spåren visualiserades som distinkta högborgar. De identifierade foci kvantifierades sedan och uttrycktes som den totala integrerade intensiteten av bromodeoxyuridin färgning i atomkärnorna. Co-staining visade differentiering mellan kortdistans samband på grund av att icke-homologa slutet sammanfogning och långväga samband av homolog rekombination med hjälp av en anti-PCNA antikropp för att identifiera celler som går igenom S-fasen.PCNA är framträdande i kärnan och når maximalt uttryck under S-fasen av cellcykeln med en ganska intensiv färgning. Resultatet i värden ritas sedan som en scatterplot för att diskriminera mellan PCNA-positiva och PCNA-negativa kärnor. PCNA-negativa resultat tas bort från data uppsättningen för att möjliggöra BrdU-intensitetsbaserad analys på grund av den låga BrdU-signalen oavsett villkor.PCNA negativa atomkärnor hyser en basal integrerad intensitet av BrdU-högborgar på 900 godtyckliga enheter och detta värde når 1 800 AU i PCNA-positiva kärnor. I siRNA-kontrolltillståndet är den integrerade intensiteten av BrdU-foci per kärna cirka 1 500 AU i PCNA-positiva kärnor. Efter en effektiv knockdown av PARP-1 med hjälp av en siRNA observerades en betydande ökning av intensiteten hos BrdU-högborgarna till cirka 1 900 AU.Denna teknik kan ge viktiga insikter i det första steget av homolog rekombination, vilket hjälper till att identifiera om ett protein är involverat i det första steget i reparationsvägen. Inkubationstiden för buffertarna före extraktionen måste hållas strikt. Överexponering för dessa buffertar kommer att leda till överdriven cellavlossning och ökad bakgrundssignal.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Mätning exocytos i de nervceller Använda FM-märkning

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Märkning hESCs och hMSCs med nanopartiklar av järnoxid för icke-invasiv in vivo-spårning med MR

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Märkning stamceller med fluorescerande färger för icke-invasiv Detection med optisk avbildning

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analys av DNA dubbel-strängen Break (DSB) Reparation i däggdjursceller

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Kvantifiering av proteiner med Peptide Immunoaffinity Anrikning kombination med masspektrometri

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Mätning Cell Kinetics cellcykelreglering med metabolisk märkning och flödescytometri

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live cellcykelanalys av<em&gt; Drosophila</em&gt; Vävnader som använder Attune Akustisk Fokusering Cytometer och Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Diskriminering och karaktärisering av heterocellulära populationer med användning av kvantitativa bildtekniker

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...