Name: assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Marie-Christine Caron'a olağanüstü teknik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri J.Y.M (CIHR FDN-388879) tarafından finanse edilen fonlarla desteklenmektedir. J.-Y.M. DNA Onarımı ve Kanser Terapötikleri'nde Tier 1 Kanada Araştırma Başkanı'nın sahibidir. J.O'S bir FRQS doktora öğrencisi ve S.Y.M frqs doktora sonrası öğrencisidir.

1. Hücre kültürü, tedavileri ve kapak hazırlığı
NOT: Işıtratlamanın yanı sıra tüm hücre kaplamaları, transeksiyonlar ve tedaviler steril bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleşmelidir.
<ol><li>1. Gün<ol>
<li>6 kuyulu bir plakaya, gerektiği kadar çok koşul için her kuyuya tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Plaka ~150,000 HeLa hücreleri transfection veya ilaç tedavisi için, istenildiği gibi. NOT: Transfecting ise, kaplama anında ters transfeksiyon...

<ol>
	<li>Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+biomarkers+of+immunotherapy+response.">DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response.</a> Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).</li><li>Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-strand+break+repair-pathway+choice+in+somatic+mammalian+cells.">DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Ronato, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+the+DNA+double-strand+break+resectosome+for+genome+protection.">Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection.</a> Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP1-driven+poly-ADP-ribosylation+regulates+BRCA1+function+in+homologous+recombination-mediated+DNA+repair.">PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair.</a> Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).</li><li>Satoh, M. S., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+poly(ADP-ribose)+formation+in+DNA+repair.">Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair.</a> Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).</li><li>Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP-1+ensures+regulation+of+replication+fork+progression+by+homologous+recombination+on+damaged+DNA.">PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).</li><li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+killing+of+BRCA2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly(ADP-ribose)+polymerase.">Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li><li>Farmer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+DNA+repair+defect+in+BRCA+mutant+cells+as+a+therapeutic+strategy.">Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy.</a> Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).</li><li>Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+PARP+inhibitors-based+targeted+cancer+therapy.">Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy.</a> Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).</li><li>Noordermeer, S. M., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance:+a+tug-of-war+in+BRCA-mutated+cells.">PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).</li><li>Caron, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribose)+polymerase-1+antagonizes+DNA+resection+at+double-strand+breaks.">Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks.</a> Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).</li><li>Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+DNA+double-strand+break+resection+intermediates+in+human+cells.">Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).</li><li>Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+recombination+proteins+are+located+at+single-stranded+DNA+regions+formed+after+DNA+damage.">Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).</li><li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection.">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li><li>Huertas, P., Cruz-Garc&#237;a, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+of+resection+tracks.">Single molecule analysis of resection tracks.</a> Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).</li><li>Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPA+phosphorylation+inhibits+DNA+resection.">RPA phosphorylation inhibits DNA resection.</a> Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).</li></ol>

Bu makalede, selülodaki DNA rezeksiyonundaki varyasyonları ölçmek için IF boyamadan yararlanan bir yöntem açıklanmaktadır. DNA rezeksiyonu üzerindeki etkiyi gözlemlemek için mevcut standart RPA boyamasıdır; ancak bu, DNA replikasyondan etkilenebilecek dolaylı bir yöntemdir. Daha önce, BrdU pozitif ve BrdU negatif hücrelerde ortaya çıkan yoğunlukları sınıflandırmak için başka bir BrdU kuruluş tabanlı DNA rezeksiyonU tekniği tanımlanmıştır. Bu yöntem, hr geçirmeyen hücrelerin a...

DNA onarım faktörlerinin modülasyonu, özellikle DNA DSB onarım eksikliği olan tümör ortamlarında kanser tedavisi için sürekli gelişen bir yöntemdir. Spesifik onarım faktörlerinin inhibisyonu, kanser hücrelerini DNA'ya zarar veren ajanlara duyarlı hale getirmek için kullanılan ustaca stratejilerden biridir. Onlarca yıllık araştırma, DNA onarım genlerinin çeşitli mutasyonlarının terapötik strateji seçimleri için biyobelirteç olarak tanımlanmasına yol açtı1. Sonuç olarak, DNA onarım alanı, kişiselleştirilmiş tıp kavramını güçlendirerek çok çeşitli tedaviler sağlamak için ilaç geliştirme merkezi haline gelmiştir. 
DSB'ler iki ana yol tarafından onarılır: NHEJ ve HR2. NHEJ yolu hataya eğilimlidir, iki DNA ucunu çok az veya hiç DNA son işleme ile hızlı bir şekilde bağlar ve protein kinaz (DNA-PKcs), Ku70/80 kompleksi, 53BP1 ve RIF1 proteinlerini içerir3. Buna karşılık, İk BRCA14 tarafından başlatılan sadık bir mekanizmadır. İk onarımında önemli bir adım, 3'-OH uçlu tek iplikli (ss) DNA'ya yol açan kırık uçların bozulması olan DNA sonu rezeksiyon işlemidir. BRCA1, 5' ila 3' DNA rezeksiyonunda yer alan rezektosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1'i oluşturan aşağı akış proteinlerinin işe alımını kolaylaştırır5.
İlk son rezeksiyon, MRE11'in endonücleaz aktivitesi ile gerçekleştirilir ve DNA2 ve EXO1 çekirdekleri tarafından daha fazla işlenmesine izin verir. Oluşturulan ssDNA çıkıntıları, daha fazla işlemden korumak için Çoğaltma ProteinI A (RPA) tarafından hızlı bir şekilde kaplanır. Daha sonra BRCA2, PALB2 ve BRCA1, RPA'nın yer değiştirmesine ve homolojiye yönelik onarım mekanizması için gerekli rad51 nükleofilamentinin montajına aracılık etmek için devreye girer. Genomik bütünlüğün en iyi şekilde sürdürülmesi için NHEJ ve İk kullanımı arasında ince bir denge gereklidir. Yol seçimi hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. İk tercihen DNA rezeksiyonun en üst seviyede olduğu S-G2 aşamalarında kullanılır ve uygun onarımı sağlamak için kardeş kromatlar mevcuttur.
Poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP-1), DSB'ye alınan en erken proteinlerden biridir. Hem rezeksiyon aktivitesini hem de NHEJ5,6'da yer alan aşağı akış efektörlerinin montajını düzenler. PARP-1, çoğaltma sırasında DNA tek iplikli kesme onarımı için de gereklidir7,8. DNA onarımındaki önemli rolü nedeniyle KANSER TEDAVILerİ OLARAK PARP inhibitörleri (PARPi) kullanılmaktadır. Birkaç hr eksikliği kanserde, PARPi tedavisi, İk eksikliği olan hücrelerin alternatif bir yol ile biriken hasarı onarma yetersizliği nedeniyle sentetik ölümcül bir yanıta yol açar9,10. Şu anda dört FDA onaylı PARPi vardır: Olaparib, Rucaparib, Niriparib ve Talazoparib (BMN 673 olarak da adlandırılır), çeşitli meme ve yumurtalık kanseri tedavileri için kullanılmaktadır11. Bununla birlikte, PARPi direnci yaygındır ve İk yeterliliğinin geri alınarak potansiyel bir neden ortaya çıkar12. Işınlama disregülasyonu varlığında PARP-1'in kaybı veya inhibisyonu, rezekozom makinelerini kontrol eder ve daha uzun ssDNA yollarının birikmesine yol 13. Bu nedenle, in vivo DNA rezeksiyonunun derinlemesine incelenmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve daha sonra kanseri tedavi etmek ve PARPi direncini yenmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.
DNA rezeksiyon olaylarını tespit etmek için çeşitli yöntemler 5. Bu yöntemlerden biri, stres kaynaklı DSB'den sonra resekte edilen DNA'nın anti-RPA antikoru kullanılarak dolaylı olarak lekelenmesine ve görselleştirilmesine izin eden klasik IF tabanlı tekniktir. Genomik DNA'nın 5-bromo-2′-deoksiyridin (BrdU) ile etiketlenmesi ve sadece ssDNA'nın tespitinin alınması DNA rezeksiyon olaylarının doğrudan ölçümüdür. DNA replikasyonu gibi birden fazla hücresel işlemde yer alan RPA'nın izlenmesini atlatmaz. Burada açıklanan yöntemde, tek bir hücre döngüsü için BrdU ile kuluçkaya yatırılan hücreler, BrdU'nun çoğaltıcı hücresel DNA'nın bir ipliğine dahil edilmesine izin verir. Rezeksiyondan sonra IF boyama, BrdU'nun sadece ssDNA formunda tespit edilmesine izin vererek, bir anti-BrdU antikoru kullanılarak gerçekleştirilir. Bu antikor sadece maruz kalan BrdU nükleotitlerine erişebilir ve çift iplikli DNA'ya entegre olanları tespit etmez. Floresan mikroskopi kullanılarak, resected DNA dakik BrdU/ssDNA odakları şeklinde görselleştirilebilir. Bu odakların nükleer yoğunluğu, DNA hasarından sonra rezeksiyonu ölçmek için bir okuma olarak kullanılabilir. Bu makalede, çoğu memeli hücre hattına uygulanabilen bu yöntemin süreçleri adım adım açıklanmaktadır. Bu yöntem, kavram kanıtı olarak selüloda DNA ucu rezeksiyonunu izlemenin basit bir yolu olarak geniş bir yardımcı olmalıdır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1:800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PARP1 (F1-23)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1:2500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti PCNA (SY12-07)</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP2-67390</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alpha tubulin (DM1A)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab7291</td>
			<td>1:100000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-BrdU</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN202</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop X-ray Irradiator</td>
			<td>Cell Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMN673</td>
			<td>MedChem Express</td>
			<td>HY-16106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromodeoxyuridine (BrdU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell profiler</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>V 3.19</td>
			<td>https://cellprofiler.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10063542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12 541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000B</td>
			<td>63x immersion objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120V</td>
			<td>VWR</td>
			<td>51030408</td>
			<td>37% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>MAG520.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SOD002.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td>Wisent Bio Products</td>
			<td>311-010-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>Cedarlane Labs</td>
			<td>15710-S(EM)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen Life Technology</td>
			<td>P-36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siPARPi</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siRNA control</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td></td>
			<td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholcate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>SUC507.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TRS001.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trition X-100</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BP337500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of global dna double-strand end resection using brdu-dna labeling coupled with cell cycle discrimination imaging

DNA hasar yanıtının (DDR) incelenmesi, kanser tedavisi için DDR hedefli ilaçların kullanımı nedeniyle daha önemli hale gelen karmaşık ve temel bir alandır. Bu hedefler, çeşitli DNA onarım biçimlerini başlatan poli (ADP-riboz) polimerazlarıdır (PARP'lar). Parp inhibitörleri (PARPi) kullanarak bu enzimlerin inhibe edilmesi, meme kanseri tip 1 (BRCA1), BRCA2 veya BRCA2 (PALB2) ortağı ve lokalizatöründeki mutasyonlar nedeniyle homolog rekombinasyon (HR) eksikliği olan hücrelerde terapötik bir güvenlik açığı sağlayarak sentetik öldürücülüğe ulaşır. 
PARPi ile tedavi edilen hücreler DNA çift iplikçik kopuları (DSB' ler) biriktirir. Bu kırılmalar DNA uç rezeksiyon makineleri tarafından işlenerek tek iplikli (ss) DNA oluşumuna ve daha sonra DNA onarımına yol açmaktadır. BRCA1 eksikliği olan bir bağlamda, 53BP1 ve DYNLL1 gibi DNA rezeksiyon inhibitörlerindeki mutasyonlar yoluyla DNA rezeksiyonunu canlandırmak PARPi direncine neden olur. Bu nedenle, selülodaki DNA rezeksiyonunun izlenebilmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve PARPi direncinin üstesinden gelmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. İmmünoresans (IF) tabanlı teknikler, DNA hasarından sonra küresel DNA rezeksiyonunun izlenmesini sağlar. Bu strateji 5-bromo-2′-deoksiyuridin (BrdU) ile uzun nabız genomik DNA etiketleme gerektirir. DNA hasarı ve DNA sonu rezeksiyonu sonrasında, ortaya çıkan tek iplikli DNA, özellikle yerel koşullar altında bir anti-BrdU antikoru tarafından tespit edilir. Ayrıca, DNA rezeksiyonu, hücre döngüsünün çeşitli aşamalarını ayırt etmek için hücre döngüsü belirteçleri kullanılarak da incelenebilir. S/G2 fazındaki hücreler İk içinde uç rezeksiyonunun incelenmesine izin verirken, G1 hücreleri homolog olmayan uç birleştirmeyi (NHEJ) incelemek için kullanılabilir. Bu IF yöntemi için hücre döngüsü ayrımcılığı ile birleştirilmiş ayrıntılı bir protokol bu makalede açıklanmıştır.

Bu protokolde Bromodeoxyuridine (BrdU) bazlı test, HeLa hücrelerinin ışınlama kaynaklı hasara rezeksiyon yanıtını nicel olarak ölçmek için kullanılmıştır. Oluşturulan ssDNA izleri immünofluoresans lekelemeden sonra farklı odaklar olarak görselleştirilir (Şekil 1A). Tanımlanan odaklar daha sonra ölçüldü ve çekirdekteki BrdU lekelemenin toplam entegre yoğunluğu olarak ifade edildi (Şekil 1B, Ek Şekil S1, Ek Şekil S2</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging at JoVE.com

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

BrdU-DNA Etiketlemesi Kullanılarak Küresel DNA Çift Telli Uç Rezeksiyonunun Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü Ayrımcılığı Görüntüleme ile birleştiğinde

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

Bu protokol, DNA hasarından sonra DNA ve rezeksiyonun selülo nicelesinde ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, hücreleri S ve G2 fazı ile sınırlayan ve bromodeoksikürin sinyalinin DNA ve rezeksiyondan elde edilmesini sağlayan hücre döngüsü işaretidir. Prosedürü gösterenler arasında baş araştırmacı Jean-Yves Masson ve doktora sonrası araştırmacı Sofiane Y.Mersaoui yer alacak.Steril bir kültür başlığı altında çalışarak, gerekli birçok koşul için altı kuyulu bir tabağın her kuyusuna tek bir kapak parçası yerleştirin. Transfeksiyon veya ilaç tedavisi için yaklaşık 150.000 HeLa hücresi plaka. Üçüncü gün, BrdU ile 10 mikromolar son konsantrasyonda gece kuluçkasını takiben, plakaları toplam beş gri doz x-ışını ışınlama ile ışınlayın.Işınlamadan sonra, üç saat boyunca% 5 karbon oksit nemlendirilmiş inkübatörde 37 santigrat derecede inkübasyon için plakaları iade edin. Ön ekstraksiyon için ortamı emiş edin ve hücreleri PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, iki mililitre ekstraksiyon öncesi tampon A ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca buz üzerinde dört santigrat derecede kuluçkaya bırakın.10 dakika sonra, A tamponunu aspire edin, iki mililitre sitoskeleton sıyırma tamponU B ekleyin ve inkübasyonu tekrarlayın. Ardından B tamponu dikkatlice emiş ve hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, kimyasal kaputun altına paraformaldehitin% 4'ünün iki mililitresini ekleyerek hücreleri sabitleyin.Paraformaldehitin çıkarılmasından ve PBS ile yıkandıktan sonra, kapak kapaklarını eksi 20 santigrat derecede inkübasyon için% 100 soğuk metanol ile beş dakika boyunca örtün ve kapakları PBS ile iki kez yıkayın. Permeabilizasyon için, hücreleri oda sıcaklığında% 0.5 Tritan X-100 içeren iki mililitre PBS ile kuluçkaya yatırın. 15 dakika sonra, kapakları iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.İmmünizasyon için, her kuyuya iki mililitre bloke tamponu ekleyin. Bir saatlik inkübasyondan sonra, her kapak sarmalına 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. Kapakları kare parafilm ile örtmek için cımbız kullanın ve kabarcıklar oluşturmamak için parafilm'i dikkatlice yerleştirin.Daha sonra plakayı alüminyum folyoya örtün ve birincil antikoru bir gecede dört santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, parafilm karelerini çıkarın ve kapakları iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Yıkamadan sonra, her kapak kapağına 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve kapakları gösterildiği gibi bir kare parafilm ile örtün.İkincil antikorun oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın ve folyo kullanarak plakayı ışıktan koruyun. Daha sonra kapakları iki mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın. Nükleer boyama için, her kapak kılıfı için iki mililitre DAPI çözeltisi ekleyin ve kapakları PBS ile yıkayın.Mikroskop slaytlarına 10 ila 20 mikrolitre IF'ye özgü montaj ortamı ekleyin. Kapak kapağını kuyunun altından kaldırmak için iğneyi veya ince cımbızı kullanın. Bir kenarı kağıt havluya hafifçe dokunarak fazla sıvıyı dikkatlice lekeleyin ve kapakları mikroskop slaytlarına monte edin.Görüntü alma ve analiz için, bu dosyaları CellProfiler'a alın ve benek sayma ardışık düzeni kullanarak analiz edin. Metin taslağında açıklanan ayarları kullanarak odakları tanımlamak için birincil nesneyi tanımlayın ve yoğunluğu ölçün. Işınlamadan sonra 5-bromo-2-prime-deoksiyuridin odak oluşumu ve çoğalan hücre nükleer antijen lekeleme temsili görüntüleri burada gösterilmiştir.Oluşturulan tek iplikli DNA izleri farklı odaklar olarak görselleştirildi. Tanımlanan odaklar daha sonra ölçülmüş ve çekirdekteki bromodeoksikürin lekelemenin toplam entegre yoğunluğu olarak ifade edilmiştir. Ko-boyama, homolog olmayan uç birleştirmesi nedeniyle kısa aralıklı rezeksiyon ile S fazından geçen hücreleri tanımlamak için bir anti-PCNA antikoru kullanılarak homolog rekombinasyonun uzun menzilli rezeksiyonu arasında farklılaşma gösterdi.PCNA çekirdekte belirgindir ve oldukça yoğun bir lekeleme ile hücre döngüsünün S aşamasında maksimum ifadeye ulaşır. Değerlerdeki sonuç daha sonra PCNA pozitif ve PCNA negatif çekirdekleri arasında ayrım yapmak için bir dağılım olarak çizilir. PCNA negatif sonuçları, durumdan bağımsız olarak düşük BrdU sinyali nedeniyle BrdU yoğunluk tabanlı analize izin vermek için veri kümesinden kaldırılır.PCNA negatif çekirdekleri, 900 keyfi birim brdU odaklarının bazal entegre yoğunluğunu barındırır ve bu değer PCNA pozitif çekirdeklerinde 1.800 AU'ya ulaşır. SiRNA kontrol durumunda, BrdU odaklarının çekirdek başına entegre yoğunluğu PCNA pozitif çekirdeğinde yaklaşık 1.500 AU'dur. Parp-1'in bir siRNA kullanılarak verimli bir şekilde devrilmesinden sonra, BrdU odaklarının yoğunluğunda yaklaşık 1.900 AU'ya önemli bir artış gözlendi.Bu teknik, homolog rekombinasyonun ilk aşaması hakkında önemli içgörüler sağlayabilir, böylece bir proteinin onarım yolunun ilk adımında yer olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilir. Ekstraksiyon öncesi tamponlar için kuluçka süresi kesinlikle tutulmalıdır. Bu arabelleklere aşırı maruz kalmak, aşırı hücre kopması ve arka plan sinyalinin artmasına neden olur.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...