Name: in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح من Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501) ، Health Holland (LSHM19057-H040) ، برنامج الزملاء الرائد Marie Skłodowska-Curie COFUND ، ومن قبل جمعية Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

1. الإعداد الإعلامي وثقافة mESC
<ol><li>تحضير وسط مكيف +/- (CM +/-) باستخدام الملحق 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) متوسط مع 10٪ (حجم / حجم) مصل جنيني بقري معطل بالحرارة (FBS) ، 0.05 مللي متر β-ميركابتوإيثانول ، 1x أحماض أمينية غير أساسية (NEAA 1x) ، 2 mM L-glutamine ، و 1 mM بيروفات الصوديوم.</li>
	<li>تحضير وسط مكيف +/+ (CM +/+) باستخدام المكمل CM ...

<ol>
	<li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery:+an+industry+perspective.">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li><li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips:+into+the+next+decade.">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks.">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li><li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery.">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li><li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods.">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li><li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+quality+beats+quantity:+Decision+theory,+drug+discovery,+and+the+reproducibility+crisis.">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).</li><li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development.">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li><li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington's+disease.">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li><li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li><li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2.">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics.">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders.">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li><li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vessels,+big+role:+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury.">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li><li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease.">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro.">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).</li><li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1.">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li><li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells:+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture.">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li><li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes.">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis.">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li><li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+intervention+of+MKL/SRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis.">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li><li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms.">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li><li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts.">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels.">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays.">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling.">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).</li><li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices.">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).</li><li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology.">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول مقايسة تنبت الأوعية الدموية غير المتحيزة والقوية والقابلة للتكرار القائمة على 3D EB والتي تكون قابلة لفحص الأدوية والجينات التي تعدل تكوين الأوعية. توفر هذه الطريقة مزايا على العديد من المقايسات ثنائية الأبعاد (2D) المستخدمة على نطاق واسع باستخدام ثقافات الخلايا البطاني?...

في العقود الثلاثة الماضية ، تم استخدام اكتشاف الأدوية القائم على الهدف (TDD) على نطاق واسع في اكتشاف الأدوية من قبل صناعة الأدوية. يتضمن TDD هدفا جزيئيا محددا يلعب دورا مهما في المرض ويعتمد على تطوير أنظمة زراعة الخلايا البسيطة نسبيا والقراءات لفحص الأدوية1. تتضمن معظم نماذج الأمراض النموذجية المستخدمة في برامج TDD طرق زراعة الخلايا التقليدية مثل الخلايا السرطانية أو خطوط الخلايا الخالدة المزروعة داخل بيئات اصطناعية وركائز غير فسيولوجية. وعلى الرغم من أن العديد من هذه النماذج قد وفر أدوات ناجعة لتحديد الأدوية المرشحة الناجحة، فإن استخدام مثل هذه النظم يمكن أن يكون موضع شك بسبب ضعف أهميتها المرضية2.
بالنسبة لمعظم الأمراض ، تكون الآليات الأساسية معقدة بالفعل وغالبا ما توجد أنواع مختلفة من الخلايا ومسارات إشارات مستقلة ومجموعات متعددة من الجينات تساهم في النمط الظاهري لمرض معين. وينطبق هذا أيضا على الأمراض الوراثية حيث يكون السبب الرئيسي هو طفرة في جين واحد. مع ظهور تقنيات الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) التي يسببها الإنسان وأدوات تحرير الجينات مؤخرا ، أصبح من الممكن الآن إنشاء عضويات ثلاثية الأبعاد ونماذج مرض عضو على رقاقة يمكن أن تلخص بشكل أفضل التعقيد البشري في الجسم الحي 3,4. يرتبط تطوير مثل هذه التقنيات بعودة الاهتمام ببرامج اكتشاف الأدوية ذات النمط الظاهري(PDD) 1. يمكن مقارنة PDD بالفحص التجريبي ، لأنها لا تعتمد على معرفة هوية هدف دواء معين أو فرضية حول دوره في المرض. ومن المسلم به الآن بشكل متزايد أن نهج PDD يساهم بقوة في اكتشاف الأدوية الأولى في فئتها5. نظرا لأن تطوير التقنيات العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة لا يزال في مهده ، فمن المتوقع أن توفر نماذج iPSC (المكملة بأدوات التصوير والتعلم الآليالمبتكرة 6,7) ، في المستقبل القريب ، نماذج جديدة متعددة للأمراض المعقدة القائمة على الخلايا لفحص الأدوية وبرامج PDD المرتبطة للتغلب على الإنتاجية الضعيفة لنهج TDD 8 ، 9.
في حين أن النماذج العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة يمكن أن توفر رؤى مهمة حول تعقيد المرض وتحديد الأدوية الجديدة ، فإن إدخال الأدوية في الممارسة السريرية الجديدة يعتمد أيضا بشدة على البيانات من النماذج الحيوانية لتقييم فعاليتها وسلامتها. من بينها ، الفئران المعدلة وراثيا هي بالتأكيد نماذج الثدييات الأكثر تفضيلا. لديهم العديد من المزايا لأن لديهم وقت جيل قصير نسبيا للثدييات ، ولديهم العديد من الأنماط الظاهرية المماثلة للأمراض البشرية ، ويمكن التلاعب بها وراثيا بسهولة. لذلك يتم استخدامها على نطاق واسع في برامج اكتشاف الأدوية10. ومع ذلك ، لا يزال سد الفجوة بين الفئران والبشر يمثل تحديا مهما11. إن تطوير نماذج الفئران في المختبر المكافئة للنماذج العضوية البشرية والأعضاء على الرقاقة يمكن أن يملأ هذه الفجوة جزئيا على الأقل لأنه سيسمح بإجراء مقارنات مباشرة بين فعالية الأدوية وسلامتها بين البيانات البشرية في الجسم الحي والبيانات البشرية في المختبر. 
هنا ، يتم وصف مقايسة تنبت الأوعية الدموية في الأجسام الجنينية للفأر (EBs). تتكون الأوعية الدموية من الخلايا البطانية (البطانة الداخلية لجدران الأوعية) ، والخلايا الجدارية (خلايا العضلات الملساء الوعائية والخلايا المحيطة)12. يعتمد هذا البروتوكول على تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs) إلى EBs الوعائية باستخدام قطرات معلقة تلخص تمايز الخلايا البطانية الجديدة وتمايز الخلايا الجدارية13,14. يمكن إنشاء ESCs الفئران بسهولة في الثقافة من اليوم المعزول 3.5 الكيسات الأريمية للفأر ذات الخلفيات الجينيةالمختلفة 15. كما أنها توفر إمكانيات للتحليل النسيلي ، وتتبع النسب ، ويمكن التلاعب بها وراثيا بسهولة لإنشاء نماذج المرض13,16.
نظرا لأن الأوعية الدموية تغذي جميع الأعضاء ، فليس من المستغرب أن ترتبط العديد من الأمراض إن لم يكن كلها بالتغيرات في الأوعية الدموية الدقيقة. في الحالات المرضية ، يمكن أن تتبنى الخلايا البطانية حالة نشطة أو يمكن أن تصبح مختلة وظيفيا مما يؤدي إلى موت الخلايا الجدارية أو الهجرة بعيدا عن الأوعية الدموية. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تكوين الأوعية الدموية المفرط أو في خلخل الأوعية الدموية ، ويمكن أن يؤدي إلى تدفق دم غير طبيعي وحاجز الأوعية الدموية المعيب مما يؤدي إلى تسرب الخلايا المناعية ، والتهاب12،17،18،19. وبالتالي ، فإن الأبحاث الخاصة بتطوير الأدوية التي تعدل الأوعية الدموية عالية ، وقد تم بالفعل تحديد العديد من اللاعبين والمفاهيم الجزيئية للاستهداف العلاجي. في هذا السياق ، فإن البروتوكول الموصوف مناسب بشكل خاص لبناء نماذج الأمراض واختبار الأدوية لأنه يلخص السمات الرئيسية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي ، بما في ذلك اختيار الطرف البطاني وخلايا الساق ، وهجرة الخلايا البطانية وانتشارها ، وتوجيه الخلايا البطانية ، وتشكيل الأنبوب ، وتجنيد الخلايا الجدارية. كما يظهر أوجه التشابه مع فحوصات الأوعية الدموية 3D الموصوفة مؤخرا بناء على تقنيات iPSC البشرية20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>Difco, BD Pharmigen</td>
			<td>214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control (Clone&#160; R35-95)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>133H401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 60 x 15mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 12-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT &#947;&#8209;secretase inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 isotype rat IgG1</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 40 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>16141-079</td>
			<td>Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60&#176;C and store at &#8722;20 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>&#160;Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 &#181;g) (1 mL)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11120166001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10&#8311; units&#160;&#160;1 mL)</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-0ne</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>771288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated anti-&#945; Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorscent mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gascompress</td>
			<td>Cutisoft</td>
			<td>45846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Cutisoft 10 x 10 cm</td>
			<td>Bsn Medical</td>
			<td>45844_00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel blotting paper, Grade GB003</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10547922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, type B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#39;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>21710082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Zinc Fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td>PHCBi</td>
			<td>MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-6, human (hIL-6)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11138600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, Starfrost</td>
			<td>Knittel glass</td>
			<td>VS113711FKB.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00110467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00148981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00093576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00154014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00096292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00099064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01658692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00097020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00156982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00153104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01052044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00114576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&#160; (2 M)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Store vials in liquid nitrogen (195.79 &#176;C) indefinitely</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1033</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&#8211;2), 79&#8211;90 (1998)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&#8211;2712 (2018)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line E14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&#8211;3642 (2001).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&#8211;8428 (1993)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&#8211;246 (2004)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB, Recombinant Human</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate 100 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler, T100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (BioXtra)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA165 , recombinant murine</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Sterile</td>
			<td>Fresenius-Kabi</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath, Lab-Line Digital</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18052A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing

تمكن التطورات الحديثة في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) وتقنيات تحرير الجينات من تطوير نماذج جديدة للأمراض القائمة على الخلايا البشرية لبرامج اكتشاف الأدوية المظهرية (PDD). على الرغم من أن هذه الأجهزة الجديدة يمكن أن تتنبأ بسلامة وفعالية الأدوية التجريبية في البشر بشكل أكثر دقة ، إلا أن تطويرها إلى العيادة لا يزال يعتمد بشدة على بيانات الثدييات ، ولا سيما استخدام نماذج أمراض الفئران. بالتوازي مع نماذج الأمراض العضوية البشرية أو الأعضاء على الرقاقة ، فإن تطوير نماذج الفئران ذات الصلة في المختبر هو بالتالي حاجة غير ملباة لتقييم فعالية الدواء المباشر ومقارنات السلامة بين الأنواع وفي الجسم الحي وفي الظروف المختبرية . هنا ، يتم وصف مقايسة تنبت الأوعية الدموية التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المتمايزة إلى أجسام جنينية (EBs). EBs الوعائية المزروعة على هلام الكولاجين 3D تطوير الأوعية الدموية الجديدة التي تتوسع ، وهي عملية تسمى تنبت تولد الأوعية. يلخص هذا النموذج السمات الرئيسية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي - تكوين الأوعية الدموية من شبكة الأوعية الدموية الموجودة مسبقا - بما في ذلك اختيار خلايا الطرف البطاني ، وهجرة الخلايا البطانية وتكاثرها ، وتوجيه الخلايا ، وتكوين الأنبوب ، وتجنيد الخلايا الجدارية. إنه قابل لفحص الأدوية والجينات التي تعدل تكوين الأوعية ويظهر أوجه التشابه مع فحوصات الأوعية الدموية ثلاثية الأبعاد (3D) الموصوفة مؤخرا بناء على تقنيات iPSC البشرية.

يظهر الشكل 1 نظرة عامة على البروتوكول لفحص تنبت الأوعية الدموية. تم فصل EBs البالغة من العمر تسعة أيام المشتقة من ثلاثة خطوط 129 / Ola mESC مستقلة (Z / Red و R1 و E14) إنزيميا إلى خلايا مفردة باستخدام كولاجيناز A. تم تلطيخ الخلايا من أجل PECAM-1 وتحليلها بواسطة فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

يستخدم هذا الفحص الخلايا الجذعية الجنينية للفأر المتمايزة إلى أجسام جنينية مستزرعة في هلام الكولاجين 3D لتحليل العمليات البيولوجية التي تتحكم في تكوين الأوعية الدموية في المختبر. يمكن تطبيق هذه التقنية لاختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، ودراسة جينات معينة في سياق عمليات الحذف القاتلة من الناحية الجنينية.

في المختبر مقايسة تنبت ثلاثية الأبعاد لتكوين الأوعية الدموية باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأر لنمذجة أمراض الأوعية الدموية واختبار الأدوية

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

يصف هذا البروتوكول مقايسة تولد الأوعية الدموية في المختبر التي تلخص العديد من ميزات تكوين الأوعية الدموية ويمكن استخدامها لاختبار الأدوية. هذه الطريقة سهلة التنفيذ في المختبر وقوية وقابلة للتطوير. لديها العديد من أوجه التشابه مع المقايسات باستخدام الخلايا البطانية البشرية والمجهرية.يحاكي هذا النموذج بقوة النمط الظاهري الذي يظهر اختيار خلية الطرف البطاني المعيبة وهجرة الخلايا البطانية الموجهة التي تؤدي إلى تكوين الأوعية المرضية. يمكن أن يوفر العمل نظرة ثاقبة حول الآليات التي تنظم تكوين الأوعية الدموية ، والجينات الرئيسية ، ومسارات الإشارات المعنية ، لا سيما عن طريق إجراء الفحص الجيني يتمثل التحدي الرئيسي في الحفاظ على جودة أو تعدد قدرات الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في الثقافة. من المهم التحقق بانتظام من مراحل تعدد القدرات ومورفولوجيا خطوط الخلايا.من المهم أيضا إجراء التنميط النووي لخطوط الخلايا لأنها تميل إلى زراعة الكروموسومات أو اكتسابها. ابدأ بطلاء بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا الستة ب 500 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ ووضعه في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الألواح المطلية بالجيلاتين باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من CM الطازج بالإضافة إلى ناقص المتوسط.للحصول على مجموعة نقية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر أو mESCs ، قم بتثريبسين لوحة زراعة الخلايا باستخدام مخزن مؤقت 10x TVP لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط تمايز الأديم المتوسط قبل نقلها إلى صفيحة الآبار الستة المطلية بالجيلاتين لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا الليفية الجنينية للفأر بالالتصاق بينما تظل mESCs معلقة. انقل معلق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر قبل عد الخلايا الحية باستخدام مقياس الدم Neubauer في صبغة Trypan الزرقاء.ثم أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من وسط تمايز الأديم المتوسط. قم بإعداد أربعة أطباق من البوليسترين منخفض المرفق 94 ملم بإضافة 15 ملليلتر من الماء المعقم إلى القاع.بعد نقل تعليق الخلية إلى خزان بلاستيكي معقم ، قم بتحميل أربعة مواضع من ماصة متعددة القنوات مع 22 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل قناة. ارفع وضع الغطاء المقلوب للطبق مقاس 94 ملم على السطح النظيف لخزانة التدفق بحيث يكون الجانب الداخلي متجها لأعلى. قم بإيداع 40 قطرة من تعليق الخلية على السطح الداخلي لكل غطاء واقلب الغطاء بعناية دون إزعاج لوضعه مرة أخرى على الطبق ، بحيث تواجه القطرات الماء.احتضان الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أربعة أيام ، معتبرا هذا يوم التمايز صفر. بعد أربعة أيام من الحضانة ، اجمع القطرات المعلقة في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر باستخدام ماصة P1000. دع رواسب EB في الأنبوب قبل إزالة المادة الطافية.أعد تعليق EBs في ثلاثة ملليلتر من وسط تمايز الأوعية الدموية 2x قبل نقل معلق EB وتوزيعه بشكل موحد في طبق مطلي بالآجار 60 ملم. احتضان الأطباق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم التاسع مع تحديث متوسط كل يومين. تحضير طبق ثقافة 35 ملم عن طريق إضافة ملليلتر واحد من وسط تنبت إلى قاعه.للحث على الهلام ، احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. اجمع EBs البالغة من العمر تسعة أيام من طبق أجار واحد في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق EBs في ملليلتر من وسط التنبت البارد لنقله إلى طبق الاستزراع المطلي بالطبقة الأولى من وسط الإنبات.قم بتوزيع EBs في جميع أنحاء اللوحة ، مع التأكد من أنها على مسافة متساوية من بعضها البعض. يجب أن يكون تكوين البرعم الأول واضحا بعد الحضانة لمدة 24 إلى 48 ساعة تقريبا. في اليوم 12 ، استخدم ملعقة لنقل جل الكولاجين الذي يحتوي على EBs بعناية إلى شريحة زجاجية.قم بإزالة السائل الزائد باستخدام ماصة وجفف الجل عن طريق وضع ورقة شاش من الكتان النايلون وبطاقات الترشيح الماصة أعلى الجل. ضع ضغطا بوزن 250 جراما لمدة دقيقتين. ثم قم بإزالة أوراق النايلون للسماح للشرائح بالجفاف في الهواء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد التجفيف ، ثبت EBs باستخدام محلول الزنك طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة المثبت قبل غسل الشرائح خمس مرات باستخدام PBS. تتخلل EBs و PBS التي تحتوي على 0.1٪ Triton X-100.بعد 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول النفاذية لغسل الشرائح خمس مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. احتضان EBs في المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة واغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق. ثم أضف الجسم المضاد الأساسي المخفف في المخزن المؤقت المانع واحتضانه عند أربع درجات مئوية طوال الليل.ثم احتضان الشرائح بالجسم المضاد الثانوي Goat anti-Rat Alexa 555 في مخزن مؤقت مانع لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ومرة واحدة بالماء قبل تركيبها للفحص المجهري. تم إجراء اختبار تولد الأوعية الدموية 3D على ثلاثة EBs مع عقارين ، DC101 و DAPT.منع كلا المركبين تدريجيا تكوين الأوعية في نموذج EB مع زيادة التركيزات. أظهرت التركيزات المختلفة للأدوية في EBs أن الجرعات العالية من DC101 تمنع عدد وطول براعم الأوعية. كان ل DAPT تأثيرات معاكسة بجرعة ميكرومول واحد لكل لتر.زاد DAPT بقوة من عدد خلايا الطرف البطاني لكل براعم وعاء لها نمط ظاهري مضلل حتى عند الجرعات المنخفضة ، مقارنة ب DC101. لوحظ وجود خلل في تنبت الأوعية الدموية في توسع الشعيرات النزفي الوراثي EBs من التحكم ACVRL1 والأنماط الجينية غير المتجانسة ACVRL1 مع العديد من الأنماط الظاهرية المضللة التي تنتشر بزوايا عشوائية بالنسبة للأوعية الأم. أدت مخاليط خط mESC من النوع البري بنسبة واحد إلى واحد مع خط mESC من النوع البري غير المسمى ، إلى مساهمة متساوية في خلايا الطرف البطاني الرائدة.تم إجراء التحليل المجهري لهذا EB الخيمري التمثيلي لتحديد الأصل الجيني لخلايا الطرف البطاني الرائدة. لتحديد تغطية الخلايا الجدارية لتنبت الوعاء ، تم تثبيت EBs وتلوينها لعلامات الخلايا البطانية ، PECAM ، وعلامة الخلايا الجدارية ، أكتين العضلات الملساء ألفا. كشفت صورة عالية التكبير أن برعم وعاء فردي كان محاطا بخلايا جدارية.تم إجراء التحويل الثنائي بعد فصل قناة اللون وتم تحديد نسبة الأوعية الموجبة PECAM التي تغطيها الخلايا الجدارية الإيجابية alpha SMA. الخلفية الوراثية لخط الخلايا الجذعية الجنينية هي أيضا عامل رئيسي يجب على الباحثين مراعاته لأن بعض الخطوط تنبت بشكل أفضل من غيرها. يمكن استخدام هذه الطريقة لإجراء الفحص الجيني باستخدام نهج RNAi أو بنك من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر التي تؤوي طفرات جينية.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...