Name: in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), des Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND und der Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO) unterstützt.

1. Medienvorbereitung und -kultur des mESC
<ol><li>Bereiten Sie konditioniertes Medium +/- (CM+/-) mit dem Nahrungsergänzungsmittel 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) Medium mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), 0,05 mM β-Mercaptoethanol, 1x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA 1x), 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat zu.</li>
	<li>Bereiten Sie konditioniertes Medium +/+ (CM+/+) unter Verwendung des Nahrungsergänzungsmittels CM+/- medium mit Leukämie-Hemmfaktor (LIF) (1.500 U/ml) und 0,1...

<ol>
	<li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery:+an+industry+perspective.">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li><li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips:+into+the+next+decade.">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks.">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li><li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery.">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li><li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods.">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li><li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+quality+beats+quantity:+Decision+theory,+drug+discovery,+and+the+reproducibility+crisis.">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).</li><li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development.">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li><li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington's+disease.">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li><li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li><li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2.">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics.">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders.">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li><li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vessels,+big+role:+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury.">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li><li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease.">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro.">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).</li><li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1.">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li><li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells:+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture.">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li><li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes.">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Herbert, S. P., Stainier, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis.">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li><li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+intervention+of+MKL/SRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis.">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li><li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms.">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li><li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts.">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels.">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays.">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling.">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).</li><li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices.">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).</li><li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology.">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt einen unvoreingenommenen, robusten und reproduzierbaren 3D-EB-basierten vaskulären Sprouting-Assay, der für das Screening auf Medikamente und Gene geeignet ist, die die Angiogenese modulieren. Diese Methode bietet Vorteile gegenüber vielen weit verbreiteten zweidimensionalen (2D) Assays, bei denen Endothelzellkulturen wie Human Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) zur Überwachung der Migration (Lateral Scratch Assay oder der Boyden-Kammer-Assay)22,23 oder der Proliferation (Zählen der Zella...

In den letzten drei Jahrzehnten wurde die zielgerichtete Wirkstoffforschung (TDD) von der pharmazeutischen Industrie in großem Umfang in der Arzneimittelforschung eingesetzt. TDD beinhaltet ein definiertes molekulares Ziel, das eine wichtige Rolle bei einer Krankheit spielt, und beruht auf der Entwicklung relativ einfacher Zellkultursysteme und Readouts für das Wirkstoff-Screening1. Zu den meisten typischen Krankheitsmodellen, die in TDD-Programmen verwendet werden, gehören traditionelle Zellkulturmethoden wie Krebszellen oder immortalisierte Zelllinien, die in künstlichen Umgebungen und unphysiologischen Substraten gezüchtet werden. Obwohl viele dieser Modelle praktikable Werkzeuge zur Identifizierung erfolgreicher Arzneimittelkandidaten zur Verfügung gestellt haben, kann der Einsatz solcher Systeme aufgrund ihrer geringen Krankheitsrelevanz fraglich sein2.
Bei den meisten Krankheiten sind die zugrunde liegenden Mechanismen in der Tat komplex und verschiedene Zelltypen, unabhängige Signalwege und mehrere Gensätze tragen oft zu einem bestimmten Krankheitsphänotyp bei. Dies gilt auch für Erbkrankheiten, bei denen die Hauptursache eine Mutation in einem einzigen Gen ist. Mit dem jüngsten Aufkommen von Technologien für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) und Geneditierungswerkzeugen ist es nun möglich, 3D-Organoide und Organ-on-Chip-Krankheitsmodelle zu generieren, die die menschliche Komplexität in vivo besser rekapitulieren könnten 3,4. Die Entwicklung solcher Technologien ist mit einem Wiederaufleben des Interesses an phänotypischen Wirkstoffforschungsprogrammen (PDD) verbunden1. PDD kann mit empirischem Screening verglichen werden, da sie nicht auf dem Wissen über die Identität eines bestimmten Wirkstoffziels oder einer Hypothese über seine Rolle bei der Krankheit beruht. Der PDD-Ansatz wird heute zunehmend als wichtiger Beitrag zur Entdeckung von First-in-Class-Medikamenten anerkannt5. Da die Entwicklung menschlicher Organoid- und Organ-on-Chip-Technologien noch in den Kinderschuhen steckt, wird erwartet, dass iPSC-Modelle (ergänzt durch innovative Bildgebungs- und maschinelle Lernwerkzeuge 6,7) in naher Zukunft mehrere neuartige komplexe zellbasierte Krankheitsmodelle für das Wirkstoffscreening und die damit verbundenen PDD-Programme bereitstellen werden, um die geringe Produktivität des TDD-Ansatzes zu überwinden8. 9. Sonstiges
Während menschliche Organoid- und Organ-on-Chip-Modelle wichtige Einblicke in die Komplexität von Krankheiten und die Identifizierung neuer Medikamente liefern können, ist die Einführung von Medikamenten in die neue klinische Praxis auch stark auf Daten aus Tiermodellen angewiesen, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit zu bewerten. Unter ihnen sind genetisch veränderte Mäuse sicherlich die am meisten bevorzugten Säugetiermodelle. Sie haben viele Vorteile, da sie eine relativ kurze Generationszeit für Säugetiere haben, viele ähnliche Phänotypen wie menschliche Krankheiten haben und leicht genetisch manipuliert werden können. Sie werden daher in großem Umfang in Arzneimittelforschungsprogrammen eingesetzt10. Die Überbrückung der Kluft zwischen Mäusen und Menschen bleibt jedoch eine wichtige Herausforderung11. Die Entwicklung von In-vitro-Mausmodellen, die humanen Organoid- und Organ-on-Chip-Modellen entsprechen, könnte diese Lücke zumindest teilweise schließen, da sie direkte Vergleiche der Wirksamkeit und Sicherheit von Medikamenten zwischen In-vivo-Maus- und In-vitro-Humandaten ermöglicht. 
In dieser Arbeit wird ein vaskulärer Keimtest in Maus-Embryoidkörpern (EBs) beschrieben. Blutgefäße bestehen aus Endothelzellen (innere Auskleidung der Gefäßwände), Wandzellen (glatte Gefäßmuskelzellen und Perizyten)12. Dieses Protokoll basiert auf der Differenzierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus in vaskularisierte EBs unter Verwendung von hängenden Tröpfchen, die die de novo Endothelzell- und Muralzelldifferenzierung rekapitulieren13,14. ES-Zellen der Maus können leicht in Kultur aus isolierten Tag-3.5-Blastozysten der Maus mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund etabliert werden15. Sie bieten auch Möglichkeiten für klonale Analysen, die Rückverfolgung von Abstammungslinien und können leicht genetisch manipuliert werden, um Krankheitsmodelle zu erstellen13,16.
Da Blutgefäße alle Organe ernähren, ist es nicht verwunderlich, dass viele, wenn nicht sogar alle, Krankheiten mit Veränderungen der Mikrogefäße verbunden sind. Unter pathologischen Zuständen können Endothelzellen einen aktivierten Zustand annehmen oder dysfunktional werden, was zum Absterben von Muralzellen oder zur Abwanderung von Blutgefäßen führt. Diese können zu einer übermäßigen Angiogenese oder zu einer Verdünnung der Gefäße führen, können einen abnormalen Blutfluss und eine defekte Blutgefäßbarriere induzieren, was zu einer Extravasation von Immunzellen und Entzündungen führt12,17,18,19. Die Forschung für die Entwicklung von Medikamenten, die Blutgefäße modulieren, ist daher hoch, und es wurden bereits mehrere molekulare Akteure und Konzepte für die therapeutische Ausrichtung identifiziert. In diesem Zusammenhang eignet sich das beschriebene Protokoll besonders für die Erstellung von Krankheitsmodellen und für die Erprobung von Medikamenten, da es die wichtigsten Merkmale der in vivo keimenden Angiogenese rekapituliert, einschließlich der Selektion von Endothelspitzen- und Stielzellen, der Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Führung von Endothelzellen, der Röhrenbildung und der Rekrutierung von Muralzellen. Es zeigt auch Ähnlichkeiten mit kürzlich beschriebenen 3D-vaskulären Assays, die auf humanen iPSC-Technologien basieren20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>Difco, BD Pharmigen</td>
			<td>214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control (Clone&#160; R35-95)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>133H401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 60 x 15mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 12-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT &#947;&#8209;secretase inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 isotype rat IgG1</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 40 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>16141-079</td>
			<td>Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60&#176;C and store at &#8722;20 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>&#160;Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 &#181;g) (1 mL)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11120166001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10&#8311; units&#160;&#160;1 mL)</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-0ne</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>771288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated anti-&#945; Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorscent mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gascompress</td>
			<td>Cutisoft</td>
			<td>45846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Cutisoft 10 x 10 cm</td>
			<td>Bsn Medical</td>
			<td>45844_00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel blotting paper, Grade GB003</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10547922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, type B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#39;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>21710082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Zinc Fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td>PHCBi</td>
			<td>MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-6, human (hIL-6)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11138600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, Starfrost</td>
			<td>Knittel glass</td>
			<td>VS113711FKB.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00110467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00148981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00093576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00154014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00096292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00099064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01658692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00097020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00156982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00153104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01052044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00114576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&#160; (2 M)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Store vials in liquid nitrogen (195.79 &#176;C) indefinitely</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1033</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&#8211;2), 79&#8211;90 (1998)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&#8211;2712 (2018)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line E14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&#8211;3642 (2001).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&#8211;8428 (1993)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&#8211;246 (2004)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB, Recombinant Human</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate 100 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler, T100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (BioXtra)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA165 , recombinant murine</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Sterile</td>
			<td>Fresenius-Kabi</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath, Lab-Line Digital</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18052A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing

Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) und Geneditierungstechnologien ermöglichen die Entwicklung neuartiger menschlicher zellbasierter Krankheitsmodelle für phänotypische Wirkstoffforschungsprogramme (PDD). Obwohl diese neuartigen Geräte die Sicherheit und Wirksamkeit von Prüfpräparaten beim Menschen genauer vorhersagen könnten, stützt sich ihre Entwicklung bis zur klinischen Entwicklung immer noch stark auf Daten von Säugetieren, insbesondere auf die Verwendung von Mauskrankheitsmodellen. Parallel zu humanen Organoid- oder Organ-on-Chip-Krankheitsmodellen ist die Entwicklung relevanter In-vitro-Mausmodelle daher ein ungedeckter Bedarf für die Bewertung direkter Arzneimittelwirksamkeits- und Sicherheitsvergleiche zwischen Spezies und In-vivo- und In-vitro-Bedingungen. In dieser Arbeit wird ein vaskulärer Keimtest beschrieben, der embryonale Stammzellen der Maus verwendet, die in Embryoidkörper (EBs) differenziert sind. Vaskularisierte EBs, die auf 3D-Kollagengel kultiviert werden, entwickeln neue Blutgefäße, die sich ausdehnen, ein Prozess, der als Keimangiogenese bezeichnet wird. Dieses Modell rekapituliert die wichtigsten Merkmale der in vivo sprießenden Angiogenese - Bildung von Blutgefäßen aus einem bereits bestehenden vaskulären Netzwerk - einschließlich der Selektion von Endothelspitzenzellen, der Migration und Proliferation von Endothelzellen, der Zellführung, der Röhrenbildung und der Rekrutierung von Muralzellen. Es ist für das Screening auf Medikamente und Gene geeignet, die die Angiogenese modulieren, und zeigt Ähnlichkeiten mit kürzlich beschriebenen dreidimensionalen (3D) vaskulären Assays, die auf humanen iPSC-Technologien basieren.

Die Protokollübersicht des Blutgefäß-Sprossen-Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Neun Tage alte EBs, die aus drei unabhängigen 129/Ola mESC-Linien (Z/Red, R1 und E14) stammten, wurden mit Hilfe von Kollagenase A enzymatisch in einzelne Zellen dissoziiert. Die Zellen wurden auf PECAM-1 gefärbt und wie beschrieben mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert. Alle Zelllinien zeigten eine robuste Endotheldifferenzierung, und es wurden keine Unterschiede in ihrer Fä...

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In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Dieser Assay verwendet embryonale Stammzellen der Maus, die in Embryoidkörperchen differenziert sind, die in 3D-Kollagengel kultiviert werden, um die biologischen Prozesse zu analysieren, die die Keimangiogenese in vitro steuern. Die Technik kann zum Testen von Medikamenten, zur Modellierung von Krankheiten und zur Untersuchung spezifischer Gene im Zusammenhang mit embryonal tödlichen Deletionen eingesetzt werden.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Dieses Protokoll beschreibt einen In-vitro-Keimungs-Angiogenese-Assay, der viele Merkmale der Bildung von Blutgefäßen rekapituliert und zum Testen von Medikamenten verwendet werden kann. Diese Methode ist einfach im Labor zu implementieren, robust und skalierbar. Es hat viele Ähnlichkeiten mit Assays, die menschliche Endothelzellen und Mikrosphären verwenden.Dieses Modell ahmt robust den Phänotyp nach, der eine fehlerhafte Selektion der Endothelspitzenzellen und eine orientierte Endothelzellmigration zeigt, die zu einer pathologischen Angiogenese führt. Die Arbeit kann Einblicke in die Mechanismen liefern, die die Angiogenese von Keimungen regulieren, die Schlüsselgene und die beteiligten Signalwege, insbesondere durch die Durchführung eines genetischen Screenings. Die größte Herausforderung besteht darin, die Qualität oder Pluripotenz embryonaler Stammzellen der Maus in Kultur zu erhalten. Die regelmäßige Überprüfung der Pluripotenzstadien und der Morphologie der Zelllinien ist wichtig.Es ist auch wichtig, eine Karyotypisierung der Zelllinien durchzuführen, da sie dazu neigen, Chromosomen zu verlieren oder zu gewinnen. Beschichten Sie zunächst eine Vertiefung der Sechs-Well-Zellkulturplatte mit 500 Mikrolitern 0,1%iger Gelatinelösung und legen Sie sie für 30 Minuten in einen Kohlendioxid-Inkubator. Waschen Sie dann die gelatinebeschichteten Platten mit PBS und fügen Sie 500 Mikroliter frisch zubereitetes CM plus Minusmedium hinzu.Um eine reine Population von embryonalen Stammzellen oder mES-Zellen der Maus zu erhalten, trypsinisieren Sie die Zellkulturplatte mit 10x TVP-Puffer für 30 Sekunden bei Raumtemperatur. Anschließend werden die Zellen in einem Milliliter Mesoderm-Differenzierungsmedium resuspendiert, bevor sie für 30 Minuten auf die mit Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platte übertragen werden, damit sich die embryonalen Fibroblasten der Maus anheften können, während die mES-Zellen in Suspension bleiben. Die Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt, bevor lebende Zellen mit einem Neubauer-Hämozytometer in Trypanblau gezählt werden.Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Volumen des Mesoderm-Differenzierungsmediums. Bereiten Sie vier 94-Millimeter-Styroporschalen mit niedrigem Aufsatz vor, indem Sie 15 Milliliter steriles Wasser auf den Boden geben.Nachdem Sie die Zellsuspension in ein steriles Kunststoffreservoir überführt haben, laden Sie vier Positionen einer Mehrkanalpipette mit 22 Mikrolitern Zellsuspension pro Kanal. Heben Sie den umgedrehten Deckel der 94-Millimeter-Schale an und legen Sie ihn mit der Innenseite nach oben auf die saubere Oberfläche des Durchlaufschranks. Geben Sie 40 Tropfen der Zellsuspension auf die Innenfläche jedes Deckels und drehen Sie den Deckel vorsichtig ohne Störung um, um ihn wieder auf die Schale zu legen, so dass die Tropfen dem Wasser zugewandt sind.Inkubieren Sie die Gerichte vier Tage lang in einem Kohlendioxid-Inkubator, wobei Sie dies als Differenzierungstag Null betrachten. Nach vier Tagen Inkubation werden die hängenden Tropfen mit einer P1000-Pipette in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Lassen Sie EB im Röhrchen sedimentieren, bevor Sie den Überstand entfernen.Resuspendieren Sie die EBs in drei Millilitern 2x vaskulärem Differenzierungsmedium, bevor Sie die EB-Suspension in eine 60-Millimeter-Agar-beschichtete Schale überführen und gleichmäßig verteilen. Inkubieren Sie die Gerichte in einem Kohlendioxid-Inkubator bis zum neunten Tag mit einer mittleren Auffrischung alle zwei Tage. Bereiten Sie eine 35-Millimeter-Kulturschale vor, indem Sie einen Milliliter des Keimmediums auf den Boden geben.Um die Gelierung einzuleiten, inkubieren Sie die Schüssel fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie neun Tage alte EBs aus einer Agarschale in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die EBs in zwei Millilitern kaltem Keimmedium, um sie in die Kulturschale zu geben, die mit der ersten Schicht Keimmedium beschichtet ist.Verteilen Sie die EBs auf der gesamten Platte und achten Sie darauf, dass sie sich in gleichem Abstand zueinander befinden. Die erste Sprossbildung sollte nach einer Inkubationszeit von etwa 24 bis 48 Stunden sichtbar sein. Verwenden Sie am 12. Tag einen Spatel, um das Kollagengel, das EBs enthält, vorsichtig auf einen Objektträger zu übertragen.Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette und dehydrieren Sie das Gel, indem Sie eine Mullfolie aus Nylonleinen und saugfähige Filterkarten auf das Gel legen. Üben Sie zwei Minuten lang Druck mit einem Gewicht von 250 Gramm aus. Entfernen Sie dann die Nylonpapiere, damit die Objektträger 30 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft trocknen können.Nach dem Trocknen fixieren Sie die EBs mit Zinklösung über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag das Fixiermittel, bevor Sie die Objektträger fünfmal mit PBS waschen. Permeabilisieren Sie die EBs und PBS, die 0,1 % Triton X-100 enthalten.Entfernen Sie nach 15 Minuten die Permeabilisierungslösung, um die Objektträger fünf Minuten lang fünfmal mit PBS zu waschen. Inkubieren Sie die EBs im Blocking-Puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur und waschen Sie sie fünf Minuten lang mit PBS. Dann den im Blockierungspuffer verdünnten Primärantikörper zugeben und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Anschließend inkubieren Sie die Objektträger mit dem Sekundärantikörper Goat Anti-Rat Alexa 555 in einem Blockierungspuffer für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation dreimal fünf Minuten lang mit PBS und einmal mit Wasser, bevor Sie sie für die Mikroskopie montieren. Der 3D-Keimungs-Angiogenese-Assay wurde an drei EBs mit zwei Wirkstoffen, DC101 und DAPT, durchgeführt.Beide Verbindungen blockierten die Angiogenese im EB-Modell progressiv mit zunehmenden Konzentrationen. Die unterschiedlichen Konzentrationen von Medikamenten in EBs zeigten, dass hohe Dosen von DC101 die Anzahl und Länge der Gefäßkeime hemmen. DAPT hatte bei einer Dosis von einem Mikromol pro Liter gegenteilige Effekte.DAPT erhöhte im Vergleich zu DC101 die Anzahl der Endothelspitzenzellen pro Gefäßsprossen, die selbst bei niedrigen Dosen einen fehlgeleiteten Phänotyp aufwiesen, stark. Defekte Gefäßsprossen wurden in hereditären hämorrhagischen Teleangiektasien-EBs aus ACVRL1-Kontroll- und ACVRL1-heterozygoten Genotypen beobachtet, wobei zahlreiche fehlgeleitete Phänotypen in zufälligen Winkeln relativ zu den Elterngefäßen sprießten. Mischungen einer Wildtyp-mESC-Linie im Verhältnis eins zu eins mit einer unmarkierten mESC-Wildtyp-Linie führten zu einem gleichen Beitrag zu den führenden Endothelspitzenzellen.Eine mikroskopische Analyse dieser repräsentativen chimären EB wurde durchgeführt, um den genotypischen Ursprung der führenden Endothelspitzenzellen zu identifizieren. Um die Bedeckung der Muralzellen des Gefäßsprosses zu quantifizieren, wurden EBs fixiert und auf Endothelzellmarker, PECAM, und Muralzellmarker, Alpha Smooth Muscle Actin, gefärbt. Ein Bild mit hoher Vergrößerung zeigte, dass ein einzelner Gefäßspross von Wandzellen umgeben war.Die binäre Transformation wurde nach Farbkanaltrennung durchgeführt und der Anteil der PECAM-positiven Gefäße, die von alpha-SMA-positiven Wandzellen bedeckt waren, quantifiziert. Auch der genetische Hintergrund der embryonalen Stammzelllinie ist ein wichtiger Faktor, den die Forscher berücksichtigen müssen, da einige Linien besser sprießen als andere. Mit dieser Methode kann ein genetisches Screening mit RNAi-Ansätzen oder einer Bank embryonaler Stammzellen der Maus durchgeführt werden, die Genmutationen aufweisen.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Forschung

Biologie

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...