Name: in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מארגון Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), תוכנית עמיתים מובילה מארי סקלודובסקה-קירי COFUND, ועל ידי האגודה Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

1. הכנת מדיה ותרבות של mESC
<ol><li>הכינו מדיום מותנה +/- (CM+/-) באמצעות התוסף 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) בינוני עם 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי (FBS) מומת חום, 0.05 mM β-מרקפטואתנול, 1x חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA 1x), 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט.</li>
	<li>הכינו מדיום מותנה +/+ (CM+/+) באמצעות התוסף CM+/- בינוני עם גורם מעכב לוקמיה (LIF) (1,...

<ol>
	<li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery:+an+industry+perspective.">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li><li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips:+into+the+next+decade.">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks.">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li><li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery.">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li><li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods.">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li><li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+quality+beats+quantity:+Decision+theory,+drug+discovery,+and+the+reproducibility+crisis.">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).</li><li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development.">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li><li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington's+disease.">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li><li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li><li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2.">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics.">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders.">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li><li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vessels,+big+role:+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury.">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li><li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease.">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro.">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).</li><li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1.">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li><li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells:+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture.">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li><li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes.">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis.">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li><li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+intervention+of+MKL/SRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis.">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li><li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms.">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li><li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts.">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels.">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays.">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling.">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).</li><li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices.">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).</li><li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology.">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הנבטת כלי דם תלת-ממדית תלת-ממדית מבוססת EB בלתי משוחדת, חזקה וניתנת לשחזור, הניתנת לבדיקה לאיתור תרופות וגנים המווסתים אנגיוגנזה. שיטה זו מציעה יתרונות על פני בדיקות דו-ממדיות (דו-ממדיות) רבות הנמצאות בשימוש נרחב באמצעות תרביות תאי אנדותל כגון תאי אנדותל של וריד הטבור...

בשלושת העשורים האחרונים, גילוי תרופות מבוססות מטרה (TDD) נעשה שימוש נרחב בגילוי תרופות על ידי תעשיית התרופות. TDD משלב מטרה מולקולרית מוגדרת הממלאת תפקיד חשוב במחלה ומסתמך על פיתוח מערכות תרבית תאים פשוטות יחסית וקריאות לבדיקת תרופות1. רוב מודלי המחלה האופייניים המשמשים בתוכניות TDD כוללים שיטות מסורתיות של תרביות תאים כגון תאים סרטניים או קווי תאים אימורטליים הגדלים בסביבות מלאכותיות ומצעים לא פיזיולוגיים. למרות שרבים מהמודלים הללו סיפקו כלים מעשיים לזיהוי מועמדים מוצלחים לתרופות, השימוש במערכות כאלה יכול להיות מוטל בספק בשל הרלוונטיות הנמוכה שלהןלמחלה 2.
עבור רוב המחלות, המנגנונים הבסיסיים הם אכן מורכבים וסוגי תאים שונים, מסלולי איתות עצמאיים וקבוצות מרובות של גנים נמצאים לעתים קרובות כתורמים לפנוטיפ מחלה ספציפי. זה נכון גם לגבי מחלות תורשתיות שבהן הגורם העיקרי הוא מוטציה בגן אחד. עם הופעתן לאחרונה של טכנולוגיות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) וכלי עריכת גנים, כעת ניתן ליצור אורגנואידים תלת-ממדיים ומודלים של מחלות איברים-על-שבב שיכולים לשחזר טוב יותר את המורכבות האנושית in vivo 3,4. הפיתוח של טכנולוגיות כאלה קשור להתעוררות מחודשת בעניין בתוכניות גילוי תרופות פנוטיפיות (PDD)1. ניתן להשוות PDD לבדיקות אמפיריות, מכיוון שהן אינן מסתמכות על ידע על זהותו של יעד תרופה ספציפי או על השערה לגבי תפקידה במחלה. גישת PDD מוכרת כיום יותר ויותר כתורמת רבות לגילוי תרופות ראשונות מסוגן5. מכיוון שהפיתוח של טכנולוגיות אורגנואידים ואיברים-על-שבב אנושיים עדיין בחיתוליו, צפוי כי מודלים iPSC (בשילוב עם כלי הדמיה ולמידת מכונהחדשניים 6,7) יספקו, בעתיד הקרוב, מספר מודלים חדשניים חדשניים מבוססי תאים מורכבים לבדיקת תרופות ותוכניות PDD נלוות כדי להתגבר על הפרודוקטיביות הירודה של גישת TDD8, 9.
בעוד שמודלים אנושיים של אורגנואידים ואיברים-על-שבב יכולים לספק תובנות חשובות על מורכבות המחלה ועל זיהוי תרופות חדשות, הכנסת תרופות לפרקטיקה קלינית חדשה מסתמכת במידה רבה גם על נתונים ממודלים של בעלי חיים כדי להעריך את יעילותן ובטיחותן. ביניהם, עכברים מהונדסים גנטית הם ללא ספק המודלים המועדפים ביותר על יונקים. יש להם יתרונות רבים מכיוון שיש להם זמן דור קצר יחסית ליונקים, יש להם פנוטיפים דומים רבים למחלות אנושיות, וניתן לבצע בהם מניפולציות גנטיות בקלות. לכן הם נמצאים בשימוש נרחב בתוכניות גילוי סמים10. עם זאת, גישור על הפער בין עכברים לבני אדם נותר אתגר חשוב11. הפיתוח של מודלים של עכברי מבחנה המקבילים למודלים של אורגנואידים אנושיים ואיבר על שבב יכול למלא את הפער הזה לפחות חלקית, שכן הוא יאפשר השוואות ישירות של יעילות ובטיחות של תרופות בין עכבר in vivo לבין נתונים אנושיים במבחנה. 
כאן מתוארת בדיקת הנבטת כלי דם בגופי עובר עכבר (EBs). כלי הדם מורכבים מתאי אנדותל (רירית פנימית של דפנות כלי הדם), תאי קיר (תאי שריר חלק של כלי דם ופריציטים)12. פרוטוקול זה מבוסס על התמיינות של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs) לתאי EB וסקולריים באמצעות טיפות תלויות המשחזרות התמיינות תאי אנדותל ותאי קיר13,14. ניתן לקבוע בקלות תאי גזע עובריים בעכבר בתרבית מבלסטוציסטים של עכבר מיום 3.5 מבודדים בעלי רקע גנטי שונה15. הם גם מספקים אפשרויות לניתוח שבטים, מעקב אחר שושלת, וניתן בקלות לבצע בהם מניפולציה גנטית כדי ליצור מודלים של מחלות13,16.
מכיוון שכלי הדם מזינים את כל האיברים, אין זה מפתיע שמחלות רבות, אם לא כולן, קשורות לשינויים בכלי הדם. בתנאים פתולוגיים, תאי אנדותל יכולים לאמץ מצב פעיל או יכולים להפוך לבלתי מתפקדים וכתוצאה מכך מוות של תאי קיר או נדידה הרחק מכלי הדם. אלה יכולים לגרום לאנגיוגנזה מוגזמת או לרפרקציה של כלי דם, יכולים לגרום לזרימת דם לא תקינה ומחסום כלי דם פגום המוביל לאקסטרווציה של תאי מערכת החיסון, ודלקת12,17,18,19. המחקר לפיתוח תרופות המווסתות את כלי הדם הוא אפוא גבוה, וכבר זוהו שחקנים ומושגים מולקולריים רבים למיקוד טיפולי. בהקשר זה, הפרוטוקול המתואר מתאים במיוחד לבניית מודלים של מחלות ולבדיקות תרופתיות, שכן הוא משחזר מאפיינים מרכזיים של אנגיוגנזה של הנבטת in vivo, כולל בחירת תאי קצה אנדותל וגבעול, נדידה ושגשוג של תאי אנדותל, הנחיית תאי אנדותל, היווצרות צינוריות וגיוס תאי קיר. הוא גם מראה קווי דמיון עם בדיקות כלי דם תלת-ממדיות שתוארו לאחרונה המבוססות על טכנולוגיות iPSC אנושיות20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>Difco, BD Pharmigen</td>
			<td>214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control (Clone&#160; R35-95)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>133H401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 60 x 15mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 12-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT &#947;&#8209;secretase inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 isotype rat IgG1</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 40 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>16141-079</td>
			<td>Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60&#176;C and store at &#8722;20 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>&#160;Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 &#181;g) (1 mL)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11120166001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10&#8311; units&#160;&#160;1 mL)</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-0ne</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>771288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated anti-&#945; Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorscent mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gascompress</td>
			<td>Cutisoft</td>
			<td>45846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Cutisoft 10 x 10 cm</td>
			<td>Bsn Medical</td>
			<td>45844_00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel blotting paper, Grade GB003</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10547922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, type B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#39;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>21710082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Zinc Fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td>PHCBi</td>
			<td>MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-6, human (hIL-6)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11138600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, Starfrost</td>
			<td>Knittel glass</td>
			<td>VS113711FKB.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00110467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00148981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00093576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00154014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00096292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00099064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01658692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00097020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00156982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00153104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01052044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00114576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&#160; (2 M)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Store vials in liquid nitrogen (195.79 &#176;C) indefinitely</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1033</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&#8211;2), 79&#8211;90 (1998)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&#8211;2712 (2018)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line E14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&#8211;3642 (2001).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&#8211;8428 (1993)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&#8211;246 (2004)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB, Recombinant Human</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate 100 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler, T100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (BioXtra)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA165 , recombinant murine</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Sterile</td>
			<td>Fresenius-Kabi</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath, Lab-Line Digital</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18052A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing

ההתקדמות האחרונה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) ובטכנולוגיות עריכת גנים מאפשרת פיתוח מודלים חדשניים של מחלות מבוססות תאים אנושיים עבור תוכניות גילוי תרופות פנוטיפיות (PDD). למרות שמכשירים חדשניים אלה יכולים לחזות את הבטיחות והיעילות של תרופות ניסיוניות בבני אדם בצורה מדויקת יותר, הפיתוח שלהם למרפאה עדיין מסתמך במידה רבה על נתוני יונקים, בעיקר השימוש במודלים של מחלות עכברים. במקביל למודלים אנושיים של אורגנואידים או מחלות איבר על שבב, פיתוח מודלים רלוונטיים של עכברי מבחנה הוא לפיכך צורך בלתי מסופק להערכת יעילות תרופות ישירות והשוואות בטיחות בין מינים ובתנאי in vivo ו - in vitro . כאן מתוארת בדיקת הנבטת כלי דם המשתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגוף עוברי (EBs). EBs וסקולריים בתרבית על ג'ל קולגן תלת-ממדי מפתחים כלי דם חדשים שמתרחבים, תהליך שנקרא אנגיוגנזה נובטת. מודל זה משחזר תכונות עיקריות של אנגיוגנזה הנבטת in vivo - היווצרות כלי דם מרשת כלי דם קיימת - כולל בחירת תאי קצה אנדותל, נדידה ושגשוג תאי אנדותל, הנחיית תאים, היווצרות צינור וגיוס תאי קיר. הוא מקובל לבדיקות סקר לתרופות וגנים המווסתים אנגיוגנזה ומראה קווי דמיון עם בדיקות כלי דם תלת מימדיות (3D) שתוארו לאחרונה המבוססות על טכנולוגיות iPSC אנושיות.

סקירת הפרוטוקול של בדיקת הנבטת כלי הדם מוצגת באיור 1. EBs בני תשעה ימים שנגזרו משלושה קווי mESC עצמאיים של 129/Ola (Z/Red, R1 ו-E14) נותקו אנזימטית לתאים בודדים באמצעות collagenase A. התאים הוכתמו עבור PECAM-1 ונותחו על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כמתואר. כל קווי התאים הציגו הת?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אנגיוגנזה נובטת במבחנה המשחזרת תכונות רבות של היווצרות כלי דם ויכולה לשמש לבדיקת תרופות. שיטה זו קלה ליישום במעבדה, חזקה וניתנת להרחבה. יש לו קווי דמיון רבים עם בדיקות באמצעות תאי אנדותל אנושיים ומיקרוספרות.מודל זה מחקה בחוזקה את הפנוטיפ המציג בחירת תאי קצה אנדותל פגומים ונדידת תאי אנדותל מכוונת המובילה לאנגיוגנזה פתולוגית. העבודה יכולה לספק תובנות לגבי המנגנונים המווסתים אנגיוגנזה מונבטת, הגנים המרכזיים ומסלולי האיתות המעורבים, בעיקר על ידי ביצוע בדיקות גנטיות האתגר העיקרי הוא שמירה על האיכות או הפלוריפוטנציה של תאי גזע עובריים של עכברים בתרבית. בדיקה סדירה של שלבי הפלוריפוטנציה והמורפולוגיה של קווי התאים חשובה.חשוב גם לבצע קריוטיפ של קווי התא כפי שהם נוטים בתרבית לאבד או להשיג כרומוזומים. התחל על ידי ציפוי באר אחת מתוך שש צלחת תרבית תאי באר עם 500 מיקרוליטר של תמיסת 0.1% ג'לטין ומניחים אותו באינקובטור פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. לאחר מכן לשטוף את צלחות מצופה ג'לטין עם PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של CM מוכן טרי פלוס מינוס בינוני.כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של תאי גזע עובריים בעכבר או mESCs, טריפסינזה את צלחת תרבית התאים עם חיץ TVP 10x למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השהה מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום התמיינות מזודרם לפני העברתם לצלחת שש בארות מצופות ג'לטין למשך 30 דקות כדי לאפשר לפיברובלסטים העובריים של העכבר להתחבר בזמן שה- mESCs נשארים בהשעיה. מעבירים את תרחיף התא לצינור של 15 מיליליטר לפני ספירת תאים חיים באמצעות המוציטומטר נויבאואר בצבע כחול טריפאן.לאחר מכן צנטריפוגו את התאים ב 200 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא בנפח מתאים של מדיום התמיינות mesoderm. הכינו ארבע צלחות פוליסטירן בעלות חיבור נמוך בקוטר 94 מ"מ על ידי הוספת 15 מיליליטר מים סטריליים לתחתית.לאחר העברת תרחיף התא למאגר פלסטיק סטרילי, יש להעמיס ארבע עמדות של פיפטה רב ערוצית עם 22 מיקרוליטר של תרחיף תאים לערוץ. הרימו והניחו את המכסה ההפוך של צלחת ה-94 מ"מ על המשטח הנקי של ארון הזרימה כשהצד הפנימי פונה כלפי מעלה. הניחו 40 טיפות של תרחיף התא על המשטח הפנימי של כל מכסה והפכו בזהירות את המכסה ללא הפרעה כדי להניח אותו בחזרה על המנה, כך שהטיפות פונות למים.לדגור על הכלים באינקובטור פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים, בהתחשב בכך כיום הבידול אפס. לאחר ארבעה ימי דגירה, אספו את הטיפות התלויות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר באמצעות פיפטה P1000. תן EB משקעים לתוך הצינור לפני הסרת supernatant.יש להשהות מחדש את ה-EBs בשלושה מיליליטר של מדיום התמיינות כלי דם פי 2 לפני העברה וחלוקה אחידה של מתלי EB בכלי מצופה אגר בקוטר 60 מ"מ. דוגרים על הכלים באינקובטור פחמן דו חמצני עד היום התשיעי עם רענון בינוני כל יומיים. הכינו צלחת תרבית של 35 מ"מ על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום ההנבטה לתחתיתה.כדי לגרום לג'לציה, לדגור על המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. אספו EBs בני תשעה ימים מצלחת אגר אחת בצינור חרוטי של 15 מיליליטר והוציאו את הסופרנטנט. משעים מחדש את ה- EBs בשני מיליליטר של מדיום הנבטה קר כדי להעביר לצלחת התרבית המצופה בשכבה הראשונה של מדיום הנבטה.פזרו את ה-EBs על כל הצלחת, וודאו שהם נמצאים במרחק שווה זה מזה. היווצרות הנבטים הראשונה צריכה להיות ניכרת לאחר הדגירה במשך כ 24 עד 48 שעות. ביום ה-12, השתמשו במרית כדי להעביר בזהירות את ג'ל הקולגן המכיל EBs למגלשת זכוכית.מוציאים את עודפי הנוזלים עם פיפטה ומייבשים את הג'ל על ידי הנחת יריעת גזה של פשתן ניילון וכרטיסי סינון סופגים על גבי הג'ל. הפעל לחץ עם משקל של 250 גרם במשך שתי דקות. לאחר מכן הסירו את ניירות הניילון כדי לאפשר לשקופיות להתייבש באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר הייבוש, יש לתקן את ה-EBs באמצעות תמיסת אבץ למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הסירו את הקיבוע לפני שטיפת המגלשות חמש פעמים עם PBS. חדרו ל-EBs ול-PBS המכילים 0.1% Triton X-100.לאחר 15 דקות, הסר את פתרון החדירה כדי לשטוף את המגלשות חמש פעמים עם PBS במשך חמש דקות. יש לדגור על ה-EBs במאגר החוסם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולשטוף עם PBS במשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדן הראשוני המדולל במאגר החוסם ודגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.לאחר מכן דגרו על המגלשות עם נוגדן משני נגד עכברוש אלקסה 555 בחיץ חוסם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות ופעם אחת במים לפני הרכבתן למיקרוסקופיה. בדיקת אנגיוגנזה נובטת תלת ממדית בוצעה על שלושה EBs עם שתי תרופות, DC101 ו- DAPT.שתי התרכובות חסמו בהדרגה את האנגיוגנזה במודל EB עם ריכוזים הולכים וגדלים. הריכוזים השונים של תרופות ב- EBs הראו כי מינונים גבוהים של DC101 מעכבים את מספר ואורך נבטי כלי הדם. ל-DAPT היו השפעות הפוכות במינון של מיקרומול אחד לליטר.DAPT הגדיל מאוד את מספר תאי קצה האנדותל לכל נבטי כלי דם בעלי פנוטיפ מוטעה אפילו במינונים נמוכים, בהשוואה ל- DC101. נבטי כלי דם פגומים נצפו בטלנגיאקטזיה דימומית תורשתית EBs מבקרת ACVRL1 ובגנוטיפים הטרוזיגוטיים ACVRL1 עם פנוטיפים רבים של הטעיה הנובטים בזוויות אקראיות ביחס לכלי האב. תערובות של קו mESC מסוג פרא ביחס של אחד לאחד עם קו מסוג פרא mESC ללא תווית, הובילו לתרומה שווה לתאי קצה האנדותל המובילים.ניתוח מיקרוסקופי של EB כימרי מייצג זה נערך כדי לזהות את המקור הגנוטיפי של תאי קצה האנדותל המובילים. כדי לכמת את כיסוי תאי הקיר של נבט כלי הדם, תוקנו ונצבעו EBs עבור סמני תאי אנדותל, PECAM, וסמן תאי קיר, אקטין שריר חלק אלפא. תמונת הגדלה גבוהה גילתה כי נבט כלי בודד אחד היה מוקף בתאי קיר.הטרנספורמציה הבינארית בוצעה לאחר הפרדת ערוצי צבע וכומת היחס בין כלי הדם החיוביים של PECAM המכוסים על ידי תאי קיר חיוביים מסוג אלפא SMA. הרקע הגנטי של קו תאי הגזע העוברי הוא גם גורם מפתח שהחוקרים חייבים לקחת בחשבון מכיוון שקווים מסוימים נובטים טוב יותר מאחרים. שיטה זו יכולה לשמש לביצוע בדיקות גנטיות באמצעות גישות RNAi או בנק של תאי גזע עובריים של עכברים המכילים מוטציות גנטיות.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Assay היווצרות צינור תא האנדותל ל<em&gt; במבחנה</em&gt; חקר אנגיוגנזה

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

ג&#39;ין משופר Nuclease אבץ אצבע מיקוד בתאי גזע עוברי האנושי

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...