Name: in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

이 작업은 Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Program Marie Skłodowska-Curie COFUND 및 Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. mESC의 배지 준비 및 배양
<ol><li>보충제를 사용하여 컨디셔닝된 배지 +/-(CM+/-)를 준비합니다. 10%(vol/vol) 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS), 0.05mM β-메르캅토에탄올, 1x 비필수 아미노산(NEAA 1x), 2mM L-글루타민 및 1mM 피루브산나트륨이 포함된 1x Glasgow MEM(G-MEM BHK-1) 배지.</li>
	<li>백혈병 억제 인자(LIF)(1,500U/mL) 및 0.1mM β-메르캅토에탄올이 포함된 보충 CM+/- 배지를 사용하여 조건화된 배지 +/+(CM+/+)를 준비합?...

<ol>
	<li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery:+an+industry+perspective.">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li><li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips:+into+the+next+decade.">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks.">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li><li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery.">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li><li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods.">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li><li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+quality+beats+quantity:+Decision+theory,+drug+discovery,+and+the+reproducibility+crisis.">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).</li><li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development.">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li><li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington's+disease.">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li><li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li><li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2.">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics.">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders.">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li><li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vessels,+big+role:+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury.">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li><li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease.">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro.">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).</li><li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1.">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li><li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells:+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture.">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li><li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes.">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis.">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li><li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+intervention+of+MKL/SRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis.">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li><li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms.">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li><li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts.">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels.">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays.">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling.">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).</li><li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices.">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).</li><li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology.">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li></ol>

이 프로토콜은 혈관신생을 조절하는 약물 및 유전자를 스크리닝할 수 있는 편향되지 않고 강력하며 재현 가능한 3D EB 기반 혈관 발아 분석을 설명합니다. 이 방법은 이동(측면 스크래치 분석 또는 Boyden 챔버 분석)22,23 또는 증식(세포 수 계산, DNA 합성 검출, 증식 마커 검출 또는 대사 분석)24을 모니터링하기 위해 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)와 같은...

지난 삼십 년 동안 표적 기반 약물 발견(TDD)은 제약 산업의 약물 발견에 널리 사용되었습니다. TDD는 질병에서 중요한 역할을 하는 정의된 분자 표적을 통합하고 약물 스크리닝을 위한 비교적 간단한 세포 배양 시스템 및 판독값의 개발에 의존합니다1. TDD 프로그램에 사용되는 가장 일반적인 질병 모델에는 암세포 또는 인공 환경 및 비생리학적 기질 내에서 성장한 불멸화된 세포주와 같은 전통적인 세포 배양 방법이 포함됩니다. 이러한 모델 중 다수가 성공적인 약물 후보를 식별하기 위한 실행 가능한 도구를 제공했지만, 질병 관련성이 낮기 때문에 이러한 시스템의 사용은 의심스러울 수 있다2.
대부분의 질병에서 기본 메커니즘은 실제로 복잡하며 다양한 세포 유형, 독립적인 신호 전달 경로 및 여러 유전자 세트가 특정 질병 표현형에 기여하는 것으로 종종 발견됩니다. 이것은 주요 원인이 단일 유전자의 돌연변이인 유전 질환의 경우에도 마찬가지입니다. 최근 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 기술과 유전자 편집 도구의 출현으로 이제 생체 내 인간 복잡성을 더 잘 요약할 수 있는 3D 오가노이드 및 장기 칩 질병 모델을 생성할 수 있습니다 3,4. 이러한 기술의 개발은 표현형 약물 발견(phenotypic drug discovery, PDD) 프로그램에 대한 관심의 부활과 관련이 있다1. PDD는 특정 약물 표적의 정체성에 대한 지식이나 질병에서의 역할에 대한 가설에 의존하지 않기 때문에 경험적 스크리닝과 비교할 수 있습니다. PDD 접근법은 이제 first-in-class 약물 발견에 크게 기여하는 것으로 점점 더 인식되고 있다5. 인간 오가노이드 및 장기 온 칩 기술의 개발은 아직 초기 단계에 있기 때문에 iPSC 모델(혁신적인 이미징 및 기계 학습 도구6,7로 보완됨)은 가까운 장래에 TDD 접근 방식의 낮은 생산성을 극복하기 위해 약물 스크리닝 및 관련 PDD 프로그램을 위한 여러 새로운 복합 세포 기반 질병 모델을 제공할 것으로 예상됩니다8, 9입니다.
인간 오가노이드 및 장기 칩 모델은 질병의 복잡성과 신약 식별에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있지만, 약물을 새로운 임상 실습에 도입하는 것은 효능과 안전성을 평가하기 위해 동물 모델의 데이터에 크게 의존합니다. 그 중에서도 유전자 변형 마우스는 확실히 가장 선호되는 포유류 모델입니다. 그들은 포유류의 생성 시간이 비교적 짧고 인간 질병과 유사한 표현형이 많으며 유전적으로 쉽게 조작할 수 있기 때문에 많은 장점이 있습니다. 따라서 약물 발견 프로그램10에서 광범위하게 사용된다. 그러나 생쥐와 인간 사이의 격차를 해소하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다11. 인간 오가노이드 및 장기 칩 모델과 동등한 시험관 내 마우스 모델의 개발은 생체 내 마우스와 체외 인간 데이터 간의 직접적인 약물 효능 및 안전성 비교를 허용하기 때문에 이 격차를 적어도 부분적으로 채울 수 있습니다.
여기서, 마우스 배아체(EB)의 혈관 발아 분석이 설명됩니다. 혈관은 내피 세포(혈관벽의 내벽), 벽화 세포(혈관 평활근 세포 및 혈관주위세포)로 구성됩니다12. 이 프로토콜은 새로운 내피 세포 및 벽화 세포 분화를 요약하는 매달린 물방울을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포(mESC)를 혈관화된 EB로 분화하는 것을 기반으로 합니다13,14. 마우스 배반포는 상이한 유전적 배경을 갖는 3.5일째 마우스 배반포로부터 배양물에서 쉽게 확립될 수 있다15. 그들은 또한 클론 분석, 혈통 추적에 대한 가능성을 제공하며 질병 모델13,16을 생성하기 위해 유전적으로 쉽게 조작할 수 있습니다.
혈관이 모든 장기에 영양을 공급하기 때문에 전부는 아니더라도 많은 질병이 미세 혈관 구조의 변화와 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 병리학적 상태에서, 내피 세포는 활성화된 상태를 채택하거나 기능 장애를 일으켜 벽화 세포 사멸 또는 혈관으로부터의 이동을 초래할 수 있다. 이들은 과도한 혈관신생 또는 혈관 희박화를 초래할 수 있고, 비정상적인 혈류를 유도할 수 있고, 면역 세포 유출 및 염증을 유발하는 혈관 장벽 결함을 유발할 수 있다12,17,18,19. 따라서 혈관을 조절하는 약물 개발에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으며 치료 표적화에 대한 여러 분자 플레이어와 개념이 이미 확인되었습니다. 이러한 맥락에서 설명된 프로토콜은 내피 팁 및 줄기 세포 선택, 내피 세포 이동 및 증식, 내피 세포 안내, 튜브 형성 및 벽화 세포 모집을 포함하여 생체 내 발아 혈관신생의 주요 특징을 요약하기 때문에 질병 모델 구축 및 약물 테스트에 특히 적합합니다. 또한 인간 iPSC 기술20을 기반으로 최근에 기술된 3D 혈관 분석과 유사성을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>Difco, BD Pharmigen</td>
			<td>214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control (Clone&#160; R35-95)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>133H401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 60 x 15mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 12-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT &#947;&#8209;secretase inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 isotype rat IgG1</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 40 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>16141-079</td>
			<td>Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60&#176;C and store at &#8722;20 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>&#160;Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 &#181;g) (1 mL)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11120166001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10&#8311; units&#160;&#160;1 mL)</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-0ne</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>771288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated anti-&#945; Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorscent mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gascompress</td>
			<td>Cutisoft</td>
			<td>45846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Cutisoft 10 x 10 cm</td>
			<td>Bsn Medical</td>
			<td>45844_00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel blotting paper, Grade GB003</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10547922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, type B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#39;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>21710082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Zinc Fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td>PHCBi</td>
			<td>MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-6, human (hIL-6)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11138600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, Starfrost</td>
			<td>Knittel glass</td>
			<td>VS113711FKB.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00110467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00148981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00093576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00154014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00096292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00099064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01658692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00097020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00156982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00153104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01052044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00114576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&#160; (2 M)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Store vials in liquid nitrogen (195.79 &#176;C) indefinitely</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1033</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&#8211;2), 79&#8211;90 (1998)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&#8211;2712 (2018)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line E14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&#8211;3642 (2001).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&#8211;8428 (1993)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&#8211;246 (2004)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB, Recombinant Human</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate 100 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler, T100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (BioXtra)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA165 , recombinant murine</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Sterile</td>
			<td>Fresenius-Kabi</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath, Lab-Line Digital</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18052A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing

유도만능줄기세포(iPSC) 및 유전자 편집 기술의 최근 발전으로 표현형 약물 발견(PDD) 프로그램을 위한 새로운 인간 세포 기반 질병 모델을 개발할 수 있습니다. 이러한 새로운 장치는 인간에서 시험용 약물의 안전성과 효능을 보다 정확하게 예측할 수 있지만, 클리닉으로의 개발은 여전히 포유류 데이터, 특히 마우스 질병 모델의 사용에 크게 의존하고 있습니다. 따라서 인간 오가노이드 또는 장기 온 칩 질병 모델과 병행하여 관련 시험관 내 마우스 모델의 개발은 종과 생체 내 및 시험관 내 조건 간의 직접적인 약물 효능 및 안전성 비교를 평가하기 위한 충족되지 않은 요구입니다. 여기에서는 배아체(EB)로 분화된 마우스 배아줄기세포를 활용하는 혈관 발아 분석법을 설명합니다. 3D 콜라겐 젤에 배양된 혈관화된 EB는 확장되는 새로운 혈관을 발달시키는데, 이를 발아 혈관신생이라고 합니다. 이 모델은 내피 팁 세포 선택, 내피 세포 이동 및 증식, 세포 유도, 튜브 형성 및 벽화 세포 모집을 포함하여 기존 혈관 네트워크에서 혈관의 생체 내 발아 혈관 신생의 주요 특징을 요약합니다. 혈관신생을 조절하는 약물 및 유전자를 스크리닝할 수 있으며 인간 iPSC 기술을 기반으로 하는 최근 설명된 3차원(3D) 혈관 분석과 유사성을 보여줍니다.

혈관 발아 분석의 프로토콜 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 3개의 독립적인 129/Ola mESC 라인(Z/Red, R1 및 E14)에서 유래한 9일 된 EB를 콜라게나제 A를 사용하여 단일 세포로 효소적으로 해리시켰습니다. 모든 세포주는 강력한 내피 분화를 나타내었고, 내피 세포로 분화하는 능력의 차이는 관찰되지 않았다. 모든 세포주는 내피 세포의 약 10.5% ± 1.3%를 생산하였다(?...

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In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

이 프로토콜은 혈관 형성의 많은 특징을 요약하고 약물 테스트에 사용할 수 있는 시험관 내 발아 혈관신생 분석을 설명합니다. 이 방법은 실험실에서 구현하기 쉽고 강력하며 확장 가능합니다. 그것은 인간 내피 세포와 미소 구체를 사용하는 분석과 많은 유사점을 가지고 있습니다.이 모델은 병리학적 혈관신생으로 이어지는 결함 있는 내피 팁 세포 선택 및 방향화된 내피 세포 이동을 보여주는 표현형을 강력하게 모방합니다. 이 연구는 특히 유전자 스크리닝을 수행함으로써 발아 혈관신생을 조절하는 메커니즘, 주요 유전자 및 관련된 신호 전달 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 주요 과제는 배양에서 마우스 배아 줄기 세포의 품질 또는 다능성을 유지하는 것입니다. 세포주의 다 능성 단계와 형태를 정기적으로 확인하는 것이 중요합니다.세포주가 염색체를 잃거나 얻기 위해 배양하는 경향이 있으므로 세포주의 핵형 분석을 수행하는 것도 중요합니다. 먼저 6웰 세포 배양 플레이트 중 1웰을 500마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅하고 이산화탄소 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 젤라틴 코팅 판을 PBS로 세척하고 500 마이크로 리터의 갓 준비된 CM 플러스 마이너스 배지를 첨가하십시오.마우스 배아 줄기 세포 또는 mESC의 순수한 집단을 얻기 위해, 실온에서 30초 동안 10x TVP 완충액으로 세포 배양 플레이트를 트립신화한다. 그런 다음 세포를 1밀리리터의 중배엽 분화 배지에 재현탁시킨 후 30분 동안 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트로 옮기기 전에 mESC가 현탁액에 머무르는 동안 마우스 배아 섬유아세포가 부착되도록 합니다. Trypan blue 염료의 Neubauer 혈구계를 사용하여 살아있는 세포를 계수하기 전에 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.그런 다음 세포를 실온에서 5분 동안 200배 G로 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 적절한 부피의 중배엽 분화 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 바닥에 15 밀리리터의 멸균 수를 추가하여 4 개의 94 밀리미터 저 부착 폴리스티렌 접시를 준비하십시오.세포 현탁액을 멸균 플라스틱 저장소로 옮긴 후, 채널당 22 마이크로리터의 세포 현탁액이 있는 다중 채널 피펫의 4개 위치를 로딩합니다. 94mm 접시의 거꾸로 된 뚜껑을 들어 올려 내부가 위를 향하도록 플로우 캐비닛의 깨끗한 표면에 놓습니다. 각 뚜껑의 안쪽 표면에 세포 현탁액 40방울을 떨어뜨리고 방해 없이 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 접시에 다시 올려 방울이 물을 향하도록 합니다.이산화탄소 인큐베이터에서 4 일 동안 배양하여 분화 0 일째로 간주합니다. 4 일간의 배양 후, P1000 피펫을 사용하여 15 밀리리터 원추형 튜브에 매달린 방울을 수집하십시오. 상등액을 제거하기 전에 튜브에 EB 침전물을 넣으십시오.EB 현탁액을 60mm 한천 코팅 접시에 옮기고 균일하게 분배하기 전에 3밀리리터의 2x 혈관 분화 배지에서 EB를 재현탁합니다. 9 일째까지 이산화탄소 인큐베이터에서 2 일마다 배지를 새로 고치십시오. 바닥에 발아 배지 1 밀리리터를 첨가하여 35 밀리미터 배양 접시를 준비합니다.겔화를 유도하려면 접시를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 15밀리리터 원뿔형 튜브에 있는 한천 접시에서 9일 된 EB를 수집하고 상층액을 제거합니다. EB를 2밀리리터의 저온 발아 배지에 재현탁하여 발아 배지의 첫 번째 층으로 코팅된 배양 접시로 옮깁니다.EB를 플레이트 전체에 분배하여 서로 동일한 거리에 있도록 합니다. 첫 번째 새싹 형성은 약 24시간에서 48시간 동안 배양한 후 분명해야 합니다. 12일째에 주걱을 사용하여 EB가 포함된 콜라겐 젤을 유리 슬라이드에 조심스럽게 옮깁니다.피펫으로 과도한 액체를 제거하고 젤 위에 나일론 린넨과 흡수성 필터 카드의 거즈 시트를 놓아 젤을 탈수합니다. 2 분 동안 250 그램의 무게로 압력을가하십시오. 그런 다음 나일론 종이를 제거하여 슬라이드가 실온에서 30분 동안 자연 건조되도록 합니다.건조 후 아연 용액을 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 EB를 고정합니다. 다음날, PBS로 슬라이드를 5회 세척하기 전에 고정액을 제거한다. 0.1% Triton X-100을 함유한 EB 및 PBS를 투과화합니다.15분 후, 투과화 용액을 제거하고 슬라이드를 5분 동안 PBS로 5회 세척하였다. EBs를 실온에서 1시간 동안 블로킹 완충액에서 배양하고 PBS로 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 차단 완충액에 희석된 1차 항체를 넣고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.이어서, 슬라이드를 염소 항-쥐 Alexa 555 2차 항체와 함께 블로킹 완충액 중에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 배양 후 슬라이드를 PBS로 5분 동안 3회 세척하고 현미경 검사를 위해 장착하기 전에 물로 1회 세척합니다. 3D 발아 혈관신생 분석은 DC101 및 DAPT의 두 가지 약물을 사용하여 3개의 EB에서 수행되었습니다.두 화합물 모두 농도가 증가함에 따라 EB 모델에서 혈관신생을 점진적으로 차단했습니다. EB의 다양한 농도의 약물은 고용량의 DC101이 혈관 새싹의 수와 길이를 억제한다는 것을 보여주었습니다. DAPT는 리터당 1마이크로몰의 용량에서 반대 효과를 나타냈습니다.DAPT는 DC101에 비해 저용량에서도 잘못된 표현형을 갖는 새싹 혈관당 내피 팁 세포의 수를 강력하게 증가시켰다. ACVRL1 대조군 및 ACVRL1 이형접합체 유전자형의 유전성 출혈성 모세혈관확장증 EB에서 결함이 있는 혈관 발아가 관찰되었으며, 모혈관에 대해 무작위 각도로 돋아나는 수많은 잘못된 표현형이 있습니다. 일대일 비율의 야생형 mESC 라인과 표지되지 않은 mESC 야생형 라인의 혼합물은 주요 내피 팁 세포에 동등한 기여를 가져왔습니다.이러한 대표적인 키메라 EB의 현미경 분석을 수행하여 주요 내피 팁 세포의 유전형 기원을 확인했습니다. 혈관 새싹의 벽화 세포 커버리지를 정량화하기 위해 EB를 고정하고 내피 세포 마커인 PECAM 및 벽화 세포 마커인 알파 평활근 액틴에 대해 염색했습니다. 고배율 이미지는 하나의 개별 혈관 새싹이 벽화 세포로 둘러싸여 있음을 보여주었습니다.색 채널 분리 후 이진 변환을 수행하고 알파 SMA 양성 벽화 세포로 덮인 PECAM 양성 혈관의 비율을 정량화했습니다. 배아 줄기 세포주의 유전적 배경은 일부 계통이 다른 계통보다 더 잘 자라기 때문에 연구자들이 고려해야 하는 핵심 요소이기도 합니다. 이 방법은 RNAi 접근법 또는 유전자 돌연변이가 있는 마우스 배아 줄기 세포 은행을 사용하여 유전자 스크리닝을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

연구

생물학

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포에 표적으로 아연 손가락 핵산 분해 효소 향상된 유전자

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

수동 선명도 삭제 마우스 난소의 혈관 구조의 3 차원 재구성

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...