Name: in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

Bu çalışma, Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND ve Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO) tarafından desteklenmiştir.

1. Medya hazırlığı ve mESC kültürü
<ol><li>%10 (vol/vol) ısı ile aktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanol, 1x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat içeren 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) besiyeri kullanarak koşullandırılmış ortam +/- (CM+/-) hazırlayın.</li>
	<li>Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF) (1.500 U / mL) ve 0.1 mM β-merkaptoetanol içeren CM + / - ortamını kullanarak şartlandırılmış ortam +/+ (CM + / +) hazırlayı...

<ol>
	<li>Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+in+phenotypic+drug+discovery:+an+industry+perspective.">Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).</li><li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease.">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li><li>Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-chips:+into+the+next+decade.">Organs-on-chips: into the next decade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).</li><li>Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-on-a-Chip:+A+new+paradigm+for+drug+development.">Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).</li><li>Hussain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+image+generation+for+drug+discovery+using+generative+adversarial+networks.">High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks.</a> Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).</li><li>Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+and+image-based+profiling+in+drug+discovery.">Machine learning and image-based profiling in drug discovery.</a> Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).</li><li>Wagner, B. K., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+sophisticated+phenotypic+screening+and+modern+mechanism-of-action+methods.">The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).</li><li>Scannell, J. W., Bosley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+quality+beats+quantity:+Decision+theory,+drug+discovery,+and+the+reproducibility+crisis.">When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis.</a> PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).</li><li>Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+considerations+for+the+use+of+genetically+engineered+mouse+models+in+drug+development.">Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development.</a> Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).</li><li>Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mind+the+gap:+models+in+multiple+species+needed+for+therapeutic+development+in+Huntington's+disease.">Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease.</a> Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).</li><li>Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+in+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).</li><li>Thalgott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+contributes+to+the+pathogenesis+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+type+2.">Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2.</a> Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+haploid+mouse+embryonic+stem+cell+biobank+resource+for+functional+genomics.">A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics.</a> Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+pericytes+for+therapeutic+approaches+to+neurological+disorders.">Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders.</a> Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).</li><li>Chade, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vessels,+big+role:+Renal+microcirculation+and+progression+of+renal+injury.">Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury.</a> Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).</li><li>Jourde-Chiche, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium+structure+and+function+in+kidney+health+and+disease.">Endothelium structure and function in kidney health and disease.</a> Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).</li><li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+and+scalable+assay+to+study+perfused+3D+angiogenic+sprouting+of+iPSC-derived+endothelial+cells+in+vitro.">Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro.</a> Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).</li><li>Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+guidance+of+emerging+vessel+sprouts+requires+soluble+Flt-1.">Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1.</a> Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).</li><li>Sato, Y., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endothelial+cell+movement+by+pericytes+and+smooth+muscle+cells:+activation+of+a+latent+transforming+growth+factor-beta+1-like+molecule+by+plasmin+during+co-culture.">Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture.</a> Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).</li><li>Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+activates+signal+transduction+pathways+resulting+in+vascular+endothelial+growth+factor+resistance+of+human+monocytes.">Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes.</a> Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).</li><li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays.">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li><li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis.">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fibrin+gel+bead+assay+for+the+study+of+angiogenesis.">Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).</li><li>Gau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+intervention+of+MKL/SRF+signaling+by+CCG-1423+impedes+endothelial+cell+migration+and+angiogenesis.">Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).</li><li>Torres-Estay, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgens+modulate+male-derived+endothelial+cell+homeostasis+using+androgen+receptor-dependent+and+receptor-independent+mechanisms.">Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms.</a> Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).</li><li>Merjaneh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-angiogenic+capacities+of+microvesicles+produced+by+skin+wound+myofibroblasts.">Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts.</a> Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Anastomosed+microvascular+network+model+with+living+capillary+networks+and+endothelial+cell-lined+microfluidic+channels.">3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Nicosia, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+ring+model+of+angiogenesis:+a+quarter+century+of+search+and+discovery.">The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).</li><li>Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-derived+endothelial+cell+sprouting+assay+in+synthetic+hydrogel+arrays.">Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays.</a> Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+vasculatures+on-chip+platforms+and+their+applications+for+organ-specific+in+vitro+modeling.">Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling.</a> Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).</li><li>Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+organ-specific+vasculature+with+organ-on-a-chip+devices.">Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices.</a> Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).</li><li>Pollet, A., den Toonder, J. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+the+vasculature+using+organ-on-chip+technology.">Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology.</a> Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).</li><li>Cochrane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+models+of+vascular+biology:+Human+induced+pluripotent+stem+cells+and+organ-on-chip+technology.">Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).</li></ol>

Bu protokol, anjiyogenezi modüle eden ilaçların ve genlerin taranmasına uygun, tarafsız, sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D EB tabanlı vasküler filizlenme testini tanımlar. Bu yöntem, göçü izlemek için İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri (HUVEC'ler) gibi endotel hücre kültürlerini kullanan yaygın olarak kullanılan birçok iki boyutlu (2D) tahlile göre avantajlar sunar (lateral çizik testi veya Boyden odası tahlili)22,23 veya proliferasyonu (hücre sayısını sayma, DNA sentezinin tespiti,</...

Son otuz yılda, hedefe dayalı ilaç keşfi (TDD), ilaç endüstrisi tarafından ilaç keşfinde yaygın olarak kullanılmaktadır. TDD, bir hastalıkta önemli bir rol oynayan tanımlanmış bir moleküler hedef içerir ve nispeten basit hücre kültürü sistemlerinin geliştirilmesine ve ilaç taraması için okumalara dayanır1. TDD programlarında kullanılan en tipik hastalık modelleri, kanser hücreleri veya yapay ortamlarda yetiştirilen ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve fizyolojik olmayan substratlar gibi geleneksel hücre kültürü yöntemlerini içerir. Bu modellerin birçoğu başarılı ilaç adaylarını tanımlamak için uygun araçlar sağlamış olsa da, bu tür sistemlerin kullanımı, zayıf hastalık alaka düzeyleri nedeniyle sorgulanabilirolabilir 2.
Çoğu hastalık için, altta yatan mekanizmalar gerçekten karmaşıktır ve çeşitli hücre tipleri, bağımsız sinyal yolları ve çoklu gen kümelerinin genellikle spesifik bir hastalık fenotipine katkıda bulunduğu bulunmuştur. Bu, birincil nedenin tek bir gendeki mutasyon olduğu kalıtsal hastalıklar için de geçerlidir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojilerinin ve gen düzenleme araçlarının son zamanlarda ortaya çıkmasıyla, in vivo insan karmaşıklığını daha iyi özetleyebilecek 3D organoidler ve çip üzerinde organ hastalığı modelleri üretmek artık mümkündür 3,4. Bu tür teknolojilerin gelişimi, fenotipik ilaç keşif (PDD) programlarına olan ilginin yeniden canlanmasıyla ilişkilidir1. PDD, belirli bir ilaç hedefinin kimliği bilgisine veya hastalıktaki rolü hakkında bir hipoteze dayanmadıkları için ampirik tarama ile karşılaştırılabilir. PDD yaklaşımı, birinci sınıf ilaçların keşfine güçlü bir şekilde katkıda bulunmak için giderek daha fazla tanınmaktadır5. İnsan organoid ve çip üzerinde organ teknolojilerinin gelişimi henüz emekleme aşamasında olduğundan, iPSC modellerinin (yenilikçi görüntüleme ve makine öğrenme araçları6,7 ile tamamlanan) yakın gelecekte, TDD yaklaşımının zayıf üretkenliğinin üstesinden gelmek için ilaç taraması ve ilgili PDD programları için çoklu yeni karmaşık hücre tabanlı hastalık modelleri sağlaması beklenmektedir8, 9.
İnsan organoid ve çip üzerinde organ modelleri, hastalık karmaşıklığı ve yeni ilaçların tanımlanması konusunda önemli bilgiler sağlayabilirken, ilaçları yeni klinik uygulamaya getirmek, etkinliklerini ve güvenliklerini değerlendirmek için hayvan modellerinden elde edilen verilere de güçlü bir şekilde dayanmaktadır. Bunlar arasında genetiği değiştirilmiş fareler kesinlikle en çok tercih edilen memeli modelleridir. Memeliler için nispeten kısa bir üretim süresine sahip olduklarından, insan hastalıklarına benzer birçok fenotipe sahip olduklarından ve genetik olarak kolayca manipüle edilebildiklerinden birçok avantaja sahiptirler. Bu nedenle ilaç keşif programlarında yaygın olarak kullanılmaktadırlar10. Bununla birlikte, fareler ve insanlar arasındaki boşluğu kapatmak, önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir11. İnsan organoid ve çip üzerinde organ modellerine eşdeğer in vitro fare modellerinin geliştirilmesi, in vivo fare ve in vitro insan verileri arasında doğrudan ilaç etkinliği ve güvenlik karşılaştırmalarına izin vereceği için bu boşluğu en azından kısmen doldurabilir .
Burada, fare embriyoid cisimlerinde (EB'ler) vasküler filizlenme testi tanımlanmıştır. Kan damarları endotel hücrelerinden (damar duvarlarının iç astarı), duvar hücrelerinden (vasküler düz kas hücreleri ve perisitler)12 oluşur. Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler), de novo endotel hücresini ve duvar hücresi farklılaşmasını özetleyen asılı damlacıklar kullanılarak vaskülarize EB'lere farklılaşmasına dayanmaktadır13,14. Fare ESC'leri izole günden itibaren kültürde kolayca kurulabilir 3.5 Farklı genetik geçmişe sahip fare blastosistleri15. Ayrıca klonal analiz, soy izleme için olanaklar sağlar ve hastalık modelleri oluşturmak için genetik olarak kolayca manipüle edilebilir13,16.
Kan damarları tüm organları beslediğinden, hepsi olmasa da birçok hastalığın mikrovaskülatürdeki değişikliklerle ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Patolojik durumlarda, endotel hücreleri aktif bir durumu benimseyebilir veya duvar hücresi ölümü veya kan damarlarından uzaklaşma ile sonuçlanan işlevsiz hale gelebilir. Bunlar aşırı anjiyogenez veya damar nadirliği ile sonuçlanabilir, anormal kan akışını ve immün hücre ekstravazasyonuna yol açan kusurlu kan damarı bariyerini ve inflamasyonu indükleyebilir12,17,18,19. Bu nedenle, kan damarlarını modüle eden ilaçların geliştirilmesine yönelik araştırmalar yüksektir ve terapötik hedefleme için çoklu moleküler oyuncular ve kavramlar zaten tanımlanmıştır. Bu bağlamda, açıklanan protokol, endotel ucu ve sap hücresi seçimi, endotel hücre göçü ve proliferasyonu, endotel hücre rehberliği, tüp oluşumu ve duvar hücresi alımı dahil olmak üzere in vivo filizlenen anjiyogenezin temel özelliklerini özetlediği için hastalık modelleri oluşturmak ve ilaç testi için özellikle uygundur. Ayrıca, insan iPSC teknolojilerine dayanan yakın zamanda tarif edilen 3D vasküler tahlillerle benzerlikler göstermektedir20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>805740</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Noble</td>
			<td>Difco, BD Pharmigen</td>
			<td>214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A21434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control (Clone&#160; R35-95)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>133H401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>640211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes 60 x 15mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes, 35 x 10 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 12-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses, 24 &#215; 50 mm</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT &#947;&#8209;secretase inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC101 isotype rat IgG1</td>
			<td>BioXcell</td>
			<td>BP0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438-5X</td>
			<td>Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x), no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>14200067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 40 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>16141-079</td>
			<td>Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60&#176;C and store at &#8722;20 &#176;C for up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>&#160;Z605212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 &#181;g) (1 mL)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11120166001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10&#8311; units&#160;&#160;1 mL)</td>
			<td>Milipore, Merck</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Greiner Bio-0ne</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>739288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>771288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>740288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated anti-&#945; Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorscent mounting media</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gascompress</td>
			<td>Cutisoft</td>
			<td>45846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Cutisoft 10 x 10 cm</td>
			<td>Bsn Medical</td>
			<td>45844_00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel blotting paper, Grade GB003</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>WHA10547922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, type B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1393-100 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow&#39;s MEM (GMEM)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>21710082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC Zinc Fixative</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td>PHCBi</td>
			<td>MCO-170AICUV-PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-6, human (hIL-6)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11138600001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide box</td>
			<td>Kartell Labware</td>
			<td>278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, Starfrost</td>
			<td>Knittel glass</td>
			<td>VS113711FKB.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00110467</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00148981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00093576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00154014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00096292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00099064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01658692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00097020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00156982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00153104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT01052044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>QT00114576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&#160; (2 M)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>A24903</td>
			<td>Store vials in liquid nitrogen (195.79 &#176;C) indefinitely</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1033</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&#8211;2), 79&#8211;90 (1998)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&#8211;2712 (2018)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line E14</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&#8211;3642 (2001).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC-1011</td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&#8211;8428 (1993)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241&#8211;246 (2004)].</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB, Recombinant Human</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-14B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155 019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Multichannel P8 x 200G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BMP-4 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 10 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>607 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 25 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>760 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 5 mL</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>606 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate 100 mM</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler, T100</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (BioXtra)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco, Thermofisher scientific</td>
			<td>15090046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGFA165 , recombinant murine</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, Sterile</td>
			<td>Fresenius-Kabi</td>
			<td>B230531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath, Lab-Line Digital</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>18052A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro three-dimensional sprouting assay of angiogenesis using mouse embryonic stem cells for vascular disease modeling and drug testing

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) ve gen düzenleme teknolojilerindeki son gelişmeler, fenotipik ilaç keşif (PDD) programları için yeni insan hücresi tabanlı hastalık modellerinin geliştirilmesine olanak sağlamaktadır. Her ne kadar bu yeni cihazlar insanlarda araştırma ilaçlarının güvenliğini ve etkinliğini daha doğru bir şekilde tahmin edebilse de, kliniğe gelişimleri hala memeli verilerine, özellikle de fare hastalığı modellerinin kullanımına dayanmaktadır. İnsan organoid veya çip üzerinde organ hastalığı modellerine paralel olarak, ilgili in vitro fare modellerinin geliştirilmesi, türler ile in vivo ve in vitro koşullar arasındaki doğrudan ilaç etkinliğini ve güvenlik karşılaştırmalarını değerlendirmek için karşılanmamış bir ihtiyaçtır. Burada, embriyoid cisimlere (EB'ler) farklılaşmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanan bir vasküler filizlenme testi tanımlanmıştır. 3D-kollajen jel üzerine kültürlenen vaskülarize EB'ler, filizlenen anjiyogenez adı verilen bir süreç olan genişleyen yeni kan damarları geliştirir. Bu model, endotel ucu hücre seçimi, endotel hücre göçü ve proliferasyonu, hücre rehberliği, tüp oluşumu ve duvar hücresi alımı dahil olmak üzere önceden var olan bir vasküler ağdan kan damarlarının in vivo filizlenen anjiyogenez-oluşumunun temel özelliklerini özetlemektedir. Anjiyogenezi modüle eden ilaçların ve genlerin taranmasına uygundur ve insan iPSC teknolojilerine dayanan yakın zamanda tarif edilen üç boyutlu (3B) vasküler tahlillerle benzerlikler gösterir.

Filizlenme tahlilinin kan damarı testine genel bakışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Üç bağımsız 129 / Ola mESC hattından (Z / Red, R1 ve E14) türetilen dokuz günlük EB'ler, kollajenaz A kullanılarak enzimatik olarak tek hücrelere ayrıştırıldı. Tüm hücre hatları sağlam endotel farklılaşması sergiledi ve endotel hücrelerine farklılaşma yeteneklerinde hiçbir fark gözlenmedi. Tüm hücre hatları endotel hücrelerinin yaklaşık% 10.5 ±% 1.3'ünü üretti (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing at JoVE.com

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

In Vitro Vasküler Hastalık Modellemesi ve İlaç Testi için Fare Embriyonik Kök Hücreleri Kullanılarak Anjiyogenezin Üç Boyutlu Filizlenme Testi

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Bu protokol, kan damarlarının oluşumunun birçok özelliğini özetleyen ve ilaçları test etmek için kullanılabilecek bir in vitro filizlenen anjiyogenez testini tanımlar. Bu yöntemin laboratuvarda uygulanması kolaydır, sağlam ve ölçeklenebilir. İnsan endotel hücrelerini ve mikrosferlerini kullanan tahlillerle birçok benzerliği vardır.Bu model, patolojik anjiyogeneze yol açan kusurlu endotel ucu hücre seçimi ve yönlendirilmiş endotel hücre migrasyonunu gösteren fenotipi sağlam bir şekilde taklit eder. Çalışma, filizlenen anjiyogenezi, anahtar genleri ve özellikle genetik tarama yaparak ilgili sinyal yollarını düzenleyen mekanizmalar hakkında fikir verebilir Asıl zorluk, kültürdeki fare embriyonik kök hücrelerinin kalitesini veya pluripotensini korumaktır. Hücre hatlarının pluripotens aşamalarını ve morfolojisini düzenli olarak kontrol etmek önemlidir.Hücre hatlarının karyotiplemesini yapmak da önemlidir, çünkü kromozomları kaybetme veya kazanma kültürüne eğilimlidirler. Altı kuyucuklu hücre kültürü plakasının bir kuyusunu 500 mikrolitre% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayarak başlayın ve 30 dakika boyunca bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre taze hazırlanmış CM artı eksi orta ekleyin.Saf bir fare embriyonik kök hücre veya mESC popülasyonu elde etmek için, hücre kültürü plakasını oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10x TVP tamponu ile deneyin. Daha sonra, mESC'ler süspansiyonda kalırken fare embriyonik fibroblastlarının yapışmasına izin vermek için hücreleri bir mililitre mezoderm farklılaşma ortamında 30 dakika boyunca jelatin kaplı altı kuyucuk plakasına aktarmadan önce yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyada bir Neubauer hemositometresi kullanarak canlı hücreleri saymadan önce hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini uygun bir mezoderm farklılaşma ortamında yeniden askıya alın. Tabana 15 mililitre steril su ekleyerek dört adet 94 milimetre düşük ataşmanlı polistiren tabak hazırlayın.Hücre süspansiyonunu steril bir plastik hazneye aktardıktan sonra, kanal başına 22 mikrolitre hücre süspansiyonuna sahip çok kanallı bir pipetin dört pozisyonunu yükleyin. 94 milimetrelik çanağın ters çevrilmiş kapağını kaldırın ve iç tarafı yukarı bakacak şekilde akış kabininin temiz yüzeyine yerleştirin. Her kapağın iç yüzeyine 40 damla hücre süspansiyonu koyun ve damlaların suya bakması için kapağı tekrar tabağa yerleştirmek için rahatsız etmeden dikkatlice ters çevirin.Bulaşıkları dört gün boyunca bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin, bunu farklılaşma günü sıfır olarak düşünün. Dört günlük inkübasyondan sonra, asılı damlaları bir P1000 pipet kullanarak 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın. Süpernatanı çıkarmadan önce EB tortusunun tüpte olmasına izin verin.EB süspansiyonunu 60 milimetrelik agar kaplı bir tabakta aktarmadan ve eşit olarak dağıtmadan önce EB'leri üç mililitre 2x vasküler farklılaşma ortamında tekrar askıya alın. Bulaşıkları bir karbondioksit inkübatöründe dokuzuncu güne kadar her iki günde bir orta tazeleme ile inkübe edin. Filizlenen ortamın bir mililitresini tabanına ekleyerek 35 milimetrelik bir kültür kabı hazırlayın.Jelleşmeyi indüklemek için, yemeği beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 15 mililitrelik konik bir tüpte bir agar kabından dokuz günlük EB'leri toplayın ve süpernatanı çıkarın. EB'leri, ilk filizlenme ortamı tabakasıyla kaplanmış kültür kabına aktarmak için iki mililitre soğuk filizlenme ortamında tekrar askıya alın.EB'leri plakanın her yerine dağıtın ve birbirlerinden eşit mesafede olduklarından emin olun. İlk filiz oluşumu, inkübasyondan sonra yaklaşık 24 ila 48 saat boyunca belirgin olmalıdır. 12. günde, EB'leri içeren kollajen jelini dikkatlice bir cam slayda aktarmak için bir spatula kullanın.Fazla sıvıyı bir pipetle çıkarın ve jelin üzerine bir gazlı bez tabakası naylon keten ve emici filtre kartları yerleştirerek jeli kurutun. İki dakika boyunca 250 gram ağırlığında basınç uygulayın. Ardından, slaytların oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasını sağlamak için naylon kağıtları çıkarın.Kuruduktan sonra, EB'leri gece boyunca dört santigrat derecede çinko çözeltisi kullanarak sabitleyin. Ertesi gün, slaytları PBS ile beş kez yıkamadan önce fiksatifi çıkarın. %0.1 Triton X-100 içeren EB ve PBS'leri geçirgenleştirin.15 dakika sonra, slaytları PBS ile beş kez beş dakika boyunca yıkamak için geçirgenlik solüsyonunu çıkarın. EB'leri bloke edici tamponda oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve PBS ile beş dakika yıkayın. Daha sonra bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil antikoru ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Daha sonra slaytları oda sıcaklığında iki saat boyunca bir bloke edici tamponda Goat anti-Rat Alexa 555 sekonder antikoru ile inkübe edin. Kuluçkadan sonra, slaytları mikroskopi için monte etmeden önce PBS ile beş dakika boyunca üç kez ve bir kez suyla yıkayın. 3D filizlenen anjiyogenez testi, DC101 ve DAPT olmak üzere iki ilaçla üç EB üzerinde gerçekleştirildi.Her iki bileşik de EB modelindeki anjiyogenezi artan konsantrasyonlarla aşamalı olarak bloke etti. EB'lerdeki çeşitli ilaç konsantrasyonları, yüksek dozda DC101'in damar filizlerinin sayısını ve uzunluğunu inhibe ettiğini göstermiştir. DAPT, litre başına bir mikromol dozunda zıt etkilere sahipti.DAPT, DC101'e kıyasla, düşük dozlarda bile yanlış yönlendirilmiş bir fenotipe sahip damar filizi başına endotel ucu hücrelerinin sayısını güçlü bir şekilde arttırmıştır. ACVRL1 kontrolünden kalıtsal hemorajik telanjiektazi EB'lerinde ve ACVRL1 heterozigot genotiplerinde ana damarlara göre rastgele açılarda filizlenen çok sayıda yanlış yönlendirilmiş fenotiple birlikte kusurlu damar filizlenmeleri gözlendi. Vahşi tip bir mESC hattının, etiketlenmemiş bir mESC vahşi tip çizgi ile bire bir oranda karışımları, önde gelen endotel ucu hücrelerine eşit bir katkı sağlamıştır.Bu temsili kimerik EB'nin mikroskobik analizi, önde gelen endotel ucu hücrelerinin genotipik kökenini tanımlamak için yapıldı. Damar filizinin duvar hücresi kapsamını ölçmek için, EB'ler endotel hücre belirteçleri, PECAM ve duvar hücresi belirteci, alfa düz kas aktini için sabitlendi ve boyandı. Yüksek büyütmeli bir görüntü, tek bir damar filizinin duvar hücreleri ile çevrili olduğunu ortaya koydu.İkili transformasyon renk kanalı ayrımından sonra yapıldı ve alfa SMA pozitif mural hücrelerin kapladığı PECAM pozitif damarların oranı ölçüldü. Embriyonik kök hücre hattının genetik arka planı, araştırmacıların bazı çizgilerin diğerlerinden daha iyi filizlendiği için göz önünde bulundurmaları gereken önemli bir faktördür. Bu yöntem, RNAi yaklaşımları veya gen mutasyonlarını barındıran bir fare embriyonik kök hücre bankası kullanılarak genetik tarama yapmak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Manyetik Rezonans Görüntüleme için in vitro Etiketleme

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Hedefleme Çinko parmak Nükleazlar Geliştirilmiş Gen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...