Name: immunophenotyping and cell sorting of human mks from human primary sources or differentiated in vitro from hematopoietic progenitors
Uploaded: 2021-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors at JoVE.com

Nous remercions Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo et Begoña García Méndez (HUCA) et Paloma Cerezo, Almudena Payero et María de la Poveda-Colomo (HCSC) pour leur soutien technique. Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions médicales (Roche SP200221001) à A.B., une bourse RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Espagne) et une subvention I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espagne et Fondos FEDER) à L.G., une subvention Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Espagne) à P.M.-B. et une bourse postdoctorale intra-muros 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, Espagne) à A.A.-H. Nous remercions Reinier van der Linden d’avoir partagé ses connaissances (et son temps), en particulier ses sages conseils sur le mélange de panneaux d’anticorps marqués multicolores et la préparation du contrôle des perles unicolores.

Des échantillons de sang total et de moelle osseuse ont été obtenus et traités conformément à la Déclaration d’Helsinki de 1964. Des échantillons de sang total ont été obtenus auprès de donneurs sains après avoir donné leur consentement éclairé (ISPA), dans le cadre d’une étude approuvée par notre comité d’éthique médicale institutionnel (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Des échantillons de moelle osseuse ont été obtenus à partir de matériel de rejet aspiré de moelle oss...

<ol>
	<li>Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Mechanisms+That+Control+Platelet+Production.">Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production.</a> Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).</li><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Incredible+Journey:+From+Megakaryocyte+Development+To+Platelet+Formation.">The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation.</a> Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+Of+The+Demarcation+Membrane+System+(DMS)+In+Megakaryocytes.">Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Couldwell, G., Machlus, K. 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P., Guti&#233;rrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Of+Megakaryocytes+From+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).</li><li>Choudry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Characterization+Of+Human+Megakaryocyte+Polyploidization+And+Lineage+Commitment.">Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment.</a> Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).</li><li>Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prospective+Isolation+Of+Viable,+High+Ploidy+Megakaryocytes+From+Adult+Murine+Bone+Marrow+By+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting.">The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting.</a> Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).</li><li>Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+Of+Human+Megakaryocytes+By+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting.">Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting.</a> Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).</li><li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+The+Quest+For+In+Vitro+Platelet+Production+By+Re-Tailoring+The+Concepts+Of+Megakaryocyte+Differentiation.">On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation.</a> Medicina. 56 (12), (2020).</li><li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Platelet+Production+For+Transfusion+Purposes:+Where+Are+We+Now.">In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now.</a> Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).</li><li>Butov, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Culture+From+Human+Bone+Marrow+Aspirates+As+A+Research+And+Diagnostic+Tool.">In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool.</a> Platelets. , 1-8 (2020).</li><li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gold+Standard+Protocol+For+Human+Megakaryocyte+Culture+Based+On+The+Analysis+Of+1,500+Umbilical+Cord+Blood+Samples.">A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples.</a> Thrombosis And Haemostasis. , (2020).</li></ol>

La plupart des recherches portant sur l’étude de la mégakaryopoïèse par cytométrie en flux se limitent à ce jour à l’identification de sous-ensembles de MC en utilisant uniquement des marqueurs de surface spécifiques à la lignée(c’est-à-direCD42A/CD42B, CD41/CD61), tandis que les stades antérieurs de différenciation du MC ont été mal examinés. Dans le présent article nous montrons une stratégie immunophenotyping pour adresser une caractérisation cytometry complète d’écoulement de meg...

Les mégacaryocytes (MKs) se développent à partir de cellules souches hématopoïétiques (CSH) à la suite d’un processus complexe appelé mégacaryopoïèse, qui est orchestré principalement par l’hormone thrombopoïétine (TPO). La vision classique de la mégacaryopoïèse décrit le voyage cellulaire des CSH à travers une succession d’étapes hiérarchiques de progéniteurs engagés et de cellules précurseurs, conduisant finalement à un MK mature. Au cours de la maturation, les MKs subissent plusieurs cycles d’endomitosis, développent un système complexe de membrane de démarcation intracellulaire (DMS), qui fournit suffisamment de surface membranaire pour la production de plaquettes, et produisent et emballent efficacement la pléthore de facteurs qui sont contenus dans les différents granules hérités par les plaquettes matures1,2,3. En conséquence, les MKs matures sont de grandes cellules (40-60 μm) caractérisées par un noyau hautement polyploïde (atteignant même >64N). Des études récentes suggèrent des voies alternatives par lesquelles les CSH se différencient en MKs en contournant les points de contrôle traditionnels d’engagement de lignée en réponse à certaines conditions physiopathologiques4,5,6,7,8,9,10,11. Ces résultats soulignent que la différenciation hématopoïétique vers le MC mature est un continuum et un processus adaptatif qui répond aux besoins biologiques.
Avec les connaissances croissantes sur la biologie cellulaire et les aspects moléculaires caractérisant la mégakaryopoïèse12,la plupart des recherches consacrées à l’étude du processus par cytométrie en flux se limitent à l’identification des MKs matures à l’aide de marqueurs de surface spécifiques à la lignée(c’est-à-dire CD42A / B, CD41 / CD61), tandis que les stades de différenciation mk antérieurs restent inexplorés. Nous avons précédemment documenté une stratégie pour mettre en scène la mégakaryopoïèse dans la moelle osseuse de souris et les cultures mk dérivées de la moelle osseuse13,14, que nous avons adaptée et appliquée à l’homme15. Dans le présent article, nous montrons une stratégie d’immunophénotypage qui permet la caractérisation de la mégakaryopoïèse, des CSH aux MKs matures, dans des sources primaires humaines (moelle osseuse -BM- et sang périphérique -PB-) ou des cultures in vitro à l’aide d’un panel intégrant des marqueurs de surface spécifiques et non spécifiques à MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT et CD71, entre autres). Malgré sa grande taille et sa fragilité, les MKs peuvent être immunophénotypés à l’aide des marqueurs de surface cellulaire mentionnés ci-dessus et enrichis par le tri cellulaire activé par fluorescence dans des conditions spécifiques de pression et de diamètre de buse pour minimiser la rupture et / ou les dommages cellulaires. Cette technique facilite les approches multi-omiques, dans le but de mieux comprendre la complexité de la mégakaryopoïèse et de la production plaquettaire dans la santé humaine et la maladie. Il convient de noter qu’il constituera un outil utile pour faciliter le diagnostic et le pronostic dans un contexte clinique de demande croissante.
Dans ce manuscrit, nous documentons une stratégie pour mettre en scène la mégacaryopoïèse humaine avec un panneau intégrant des marqueurs de surface spécifiques et non spécifiques au MC provenant de sources primaires ou générés in vitro. De plus, nous fournissons un protocole pour trier, avec un trieur de cellules activé par fluorescence, les fractions préférées et les MKs matures (Figure 1). Cette étape n’est pas populaire, car elle est techniquement difficile en raison de la grande taille et de la fragilité des Clés. Cependant, il a été utilisé à la fois dans des échantillons de moelle osseuse de souris et d’homme précédemment, et en raison des progrès technologiques, avec un meilleur résultat à chaque fois16,17,18. Les sources primaires humaines où les précurseurs de MKs ou de MK peuvent être étudiés incluent la moelle osseuse, le sang de cordon et le sang périphérique, entre autres. Le traitement approprié de l’échantillon pour isoler la fraction cellulaire pertinente pour l’analyse sur chaque échantillon est important. Des procédures standard sont incorporées, avec certaines considérations à prendre en compte lors de l’étude de la mégakaryopoïèse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>130 micron Nozzle</td>
			<td>BD</td>
			<td>643943</td>
			<td>required for MK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell isolation and washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Swing Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell isolation and washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge</td>
			<td>ELITech Group</td>
			<td></td>
			<td>Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Galaxy 170 S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>To prepare cytospins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Lasers 488-nm and 633-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX 41</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX 61</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoe Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To obtain PBMCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4646</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07801</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Erythropoietin (EPO)</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human stem cell factor (SCF)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&#8482;</td>
			<td>PHC2115</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&#8482;</td>
			<td>PHC9514</td>
			<td>or TPO receptor agonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>Antibodies for human cells are generally from mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 AF-647</td>
			<td>BD</td>
			<td>561654</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 FITC</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>31F-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>555821</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41 PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555467</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD</td>
			<td>333148</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42A APC</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>42AA-100T</td>
			<td>We observed unspecific binding... that needs to be assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42A PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>558819</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42B PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303910</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49B PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555669</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD61 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>555753</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD71 APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>334109</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>564219</td>
			<td>Fc blocking - control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>313212</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cocktail 2 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>643397</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R6513</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-500</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93443-500ML</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers for sorting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrics Filters 100 micrometers</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2328</td>
			<td>Cell strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols&#160; - unless otherwise specified.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping and cell sorting of human mks from human primary sources or differentiated in vitro from hematopoietic progenitors

La différenciation des mégacaryocytes (MK) englobe un certain nombre de cycles endomitotiques qui se traduisent par une cellule très polyploïde (atteignant même >64N) et extrêmement grande (40-60 μm). Contrairement à l’augmentation rapide des connaissances sur la mégakaryopoïèse au niveau de la biologie cellulaire et moléculaire, la caractérisation de la mégakaryopoïèse par cytométrie en flux se limite à l’identification des MKs matures à l’aide de marqueurs de surface spécifiques à la lignée, tandis que les stades antérieurs de différenciation mk restent inexplorés. Ici, nous présentons une stratégie d’immunophenotyping qui permet l’identification des étapes successives de différenciation de MK, avec le statut mentoïdique croissant, dans les sources primaires humaines ou les cultures in vitro avec un panneau intégrant des marqueurs de surface spécifiques et non spécifiques de MK. Malgré sa taille et sa fragilité, les MKs peuvent être immunophénotypés à l’aide du panneau mentionné ci-dessus et enrichis par tri cellulaire activé par fluorescence dans des conditions spécifiques de pression et de diamètre de buse. Cette approche facilite les études multi-omiques, dans le but de mieux comprendre la complexité de la mégacaryopoïèse et de la production de plaquettes chez l’homme. Une meilleure caractérisation de megakaryopoiesis peut poser fondamental dans le diagnostic ou le pronostic des pathologies et de la malignité Lignage-connexes.

Moelle osseuse et onoïdie Sur la figure 4, nous montrons une analyse immunophénotypage représentative de la mégakaryopoïèse dans des échantillons de BM (aspiration) provenant de patients. En traçant la fraction cellulaire par rapport à CD71 et CD31, nous avons rated six populations principales: CD31- CD71- (rouge), CD31- CD71+ (bleu), CD31+ CD71- (orange), CD31+ CD71<sup...

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Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Ici, nous présentons une stratégie d’immunophenotyping pour la caractérisation de la différenciation de megakaryocyte, et montrons comment cette stratégie permet le tri des megakaryocytes à différentes étapes avec un trieur de cellules fluorescence-activé. La méthodologie peut être appliquée aux tissus primaires humains, mais aussi aux mégacaryocytes générés en culture in vitro.

Immunophénotypage et tri cellulaire des MKs humains provenant de sources primaires humaines ou différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Hello.Je suis Andrea Acebes Huerta.Chercheur postdoctoral au Laboratoire de recherche plaquettaire faisant partie de l’Institut de recherche en santé de la Principauté des Asturies, ISPA. Qui est situé à Oviedo, Spain.Hello.I suis Laura Guti

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Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve cellules souches adultes Isolation de cultures de fibroblastes humains primaires

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolation des myofibroblastes primaires de souris et de tissus du côlon humain

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...