Name: immunophenotyping and cell sorting of human mks from human primary sources or differentiated in vitro from hematopoietic progenitors
Uploaded: 2021-08-07T15:00:00
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Agradecemos a Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo e Begoña García Méndez (HUCA) e Paloma Cerezo, Almudena Payero e María de la Poveda-Colomo (HCSC) pelo apoio técnico. Este trabalho foi parcialmente apoiado por Bolsas Médicas (Roche SP200221001) para A.B., uma bolsa da RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha) e uma subvenção I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espanha e Fondos FEDER) para L.G., um Subsídio Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Astúrias, Espanha) para P.M.-B. e uma bolsa de pós-doutorado intramuros 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Astúrias - FINBA, Oviedo, Espanha) para A.A.-H. Agradecemos a Reinier van der Linden por compartilhar seu conhecimento (e tempo), especialmente seus sábios conselhos sobre a mistura de painel de anticorpos com várias cores e a preparação do controle de contas de cor única.

Amostras de sangue e medula óssea inteiras foram obtidas e processadas de acordo com a Declaração de Helsinque de 1964. Amostras de sangue integrais foram obtidas de doadores saudáveis após o consentimento informado (ISPA), dentro de um estudo aprovado pelo nosso comitê de ética médica institucional (Hospital Universitário Central de Astúrias -HUCA-). Amostras de medula óssea foram obtidas a partir do material de descarte aspirado de medula óssea de pacientes administrados no Departamento de Hematologia do Ho...

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P., Guti&#233;rrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Of+Megakaryocytes+From+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).</li><li>Choudry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Characterization+Of+Human+Megakaryocyte+Polyploidization+And+Lineage+Commitment.">Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment.</a> Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).</li><li>Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prospective+Isolation+Of+Viable,+High+Ploidy+Megakaryocytes+From+Adult+Murine+Bone+Marrow+By+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting.">The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting.</a> Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).</li><li>Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+Of+Human+Megakaryocytes+By+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting.">Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting.</a> Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).</li><li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+The+Quest+For+In+Vitro+Platelet+Production+By+Re-Tailoring+The+Concepts+Of+Megakaryocyte+Differentiation.">On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation.</a> Medicina. 56 (12), (2020).</li><li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Platelet+Production+For+Transfusion+Purposes:+Where+Are+We+Now.">In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now.</a> Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).</li><li>Butov, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Culture+From+Human+Bone+Marrow+Aspirates+As+A+Research+And+Diagnostic+Tool.">In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool.</a> Platelets. , 1-8 (2020).</li><li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gold+Standard+Protocol+For+Human+Megakaryocyte+Culture+Based+On+The+Analysis+Of+1,500+Umbilical+Cord+Blood+Samples.">A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples.</a> Thrombosis And Haemostasis. , (2020).</li></ol>

A maior parte da pesquisa com foco no estudo da megacariopoiese por citometria de fluxo é até hoje limitada à identificação de subconjuntos MK usando apenas marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja,CD42A/CD42B, CD41/CD61), enquanto estágios anteriores de diferenciação de MK foram mal examinados. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteping para abordar uma caracterização abrangente da citometria de fluxo da megacariopoiese humana. No geral, gostaríamos de destac...

Os megacariócitos (MKs) desenvolvem-se a partir de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) seguindo um processo complexo chamado megacariiopoiese, que é orquestrado principalmente pelo hormônio trombopoietina (TPO). A visão clássica da megacaripoiese descreve a jornada celular dos HSCs através de uma sucessão de estágios hierárquicos de progenitores comprometidos e células precursoras, levando finalmente a um MK maduro. Durante a maturação, os MKs experimentam múltiplas rodadas de endomitose, desenvolvem um intrincado sistema de membrana intracelular (DMS), que fornece superfície de membrana suficiente para a produção de plaquetas, e produzem e embalam eficientemente a infinidade de fatores que estão contidos nos diferentes grânulos herdados pelas plaquetas maduras1,2,3. Como resultado, MKs maduros são células grandes (40-60 μm) caracterizadas por um núcleo altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N). Estudos recentes sugerem rotas alternativas pelas quais os HSCs se diferenciam em MKs contornando os pontos de verificação tradicionais de compromisso de linhagem em resposta a certas condições fisio-patológicas4,5,6,7,8,9,10,11. Esses achados destacam que a diferenciação hematopoiética em relação ao MK maduro é um processo contínuo e adaptativo que responde às necessidades biológicas.
Com o crescente conhecimento sobre a biologia celular e os aspectos moleculares caracterizando a megacariopoiese12, a maioria das pesquisas dedicadas ao estudo do processo por citometria de fluxo estão limitadas à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja, CD42A/B, CD41/CD61), enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Documentamos anteriormente uma estratégia para encenar megacaripoiesis em medula óssea de camundongos e culturas MK derivadas da medula óssea13,14, que adaptamos e aplicamos aos humanos15. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteca que permite a caracterização da megacariiopoiese, dos HSCs aos MKs maduros, em fontes primárias humanas (medula óssea -BM e sangue periférico -PB-) ou culturas in vitro utilizando um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT e CD71, entre outros). Apesar de seu grande tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando os marcadores de superfície celular acima mencionados e enriquecidos pela classificação celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal para minimizar a ruptura celular e/ou danos. Essa técnica facilita abordagens multi-Omics, com o objetivo de compreender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas na saúde humana e na doença. Vale ressaltar que será uma ferramenta útil para auxiliar o diagnóstico e o prognóstico em um contexto clínico de crescente demanda.
Neste manuscrito documentamos uma estratégia para encenar megacaripoiesis humanas com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK de fontes primárias ou gerados in vitro. Além disso, fornecemos um protocolo para classificar, com um classificador celular ativado por fluorescência, as frações preferidas e MKs maduros(Figura 1). Este passo não é popular, pois é tecnicamente difícil devido ao grande tamanho e fragilidade dos MKs. No entanto, tem sido empregado tanto em amostras de camundongos quanto de medula óssea humana anteriormente, e devido ao avanço tecnológico, com melhor resultado a cada vez16,17,18. Fontes primárias humanas onde mks ou precursores mk podem ser estudados incluem medula óssea, sangue do cordão umbilical e sangue periférico, entre outros. O processamento adequado da amostra para isolar a fração celular relevante para análise em cada amostra é de importância. Os procedimentos padrão são incorporados, com algumas considerações a serem consideradas ao mirar no estudo da megacaripoiese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>130 micron Nozzle</td>
			<td>BD</td>
			<td>643943</td>
			<td>required for MK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell isolation and washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Swing Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell isolation and washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge</td>
			<td>ELITech Group</td>
			<td></td>
			<td>Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Galaxy 170 S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>To prepare cytospins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Lasers 488-nm and 633-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX 41</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX 61</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoe Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To obtain PBMCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4646</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07801</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Erythropoietin (EPO)</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human stem cell factor (SCF)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&#8482;</td>
			<td>PHC2115</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&#8482;</td>
			<td>PHC9514</td>
			<td>or TPO receptor agonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>Antibodies for human cells are generally from mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 AF-647</td>
			<td>BD</td>
			<td>561654</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 FITC</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>31F-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>555821</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41 PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555467</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD</td>
			<td>333148</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42A APC</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>42AA-100T</td>
			<td>We observed unspecific binding... that needs to be assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42A PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>558819</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42B PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303910</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49B PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555669</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD61 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>555753</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD71 APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>334109</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>564219</td>
			<td>Fc blocking - control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>313212</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cocktail 2 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>643397</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R6513</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-500</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93443-500ML</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers for sorting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrics Filters 100 micrometers</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2328</td>
			<td>Cell strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols&#160; - unless otherwise specified.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping and cell sorting of human mks from human primary sources or differentiated in vitro from hematopoietic progenitors

A diferenciação de megacariócito (MK) abrange uma série de ciclos endomitóticos que resultam em uma célula altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N) e extremamente grande (40-60 μm). Ao contrário do rápido crescimento do conhecimento em megacaripoiesis na biologia celular e no nível molecular, a caracterização da megacariopoiese por citometria de fluxo limita-se à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos da linhagem, enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping que permite a identificação de estágios sucessivos de diferenciação de MK, com status ploidy crescente, em fontes primárias humanas ou culturas in vitro com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK. Apesar de seu tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando o painel acima mencionado e enriquecidos pela triagem celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal. Essa abordagem facilita estudos multi-Omics, com o objetivo de entender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas em humanos. Uma melhor caracterização da megacaritopoiese pode representar fundamental no diagnóstico ou prognóstico de patologias e malignidade relacionadas à linhagem.

Medula Óssea e Ploidy Na Figura 4, mostramos uma análise representativa de imunofenofoteping de megacaripoiese em amostras de BM (aspiração) de pacientes. Ao traçar a fração celular contra CD71 e CD31, temos fechado seis populações principais: CD31- CD71- (vermelho), CD31- CD71+ (azul), CD31+ CD71- (laranja), CD31+ CD71mid (verde claro), CD31+ CD71<...

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Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.

Imunofenoftipagem e Triagem celular de MKs humanos de fontes primárias humanas ou in vitro diferenciados de progenitores hematopoiéticos

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Olá.Sou Andrea Acebes Huerta.Pesquisadora de pós-doutorado no Laboratório de Pesquisa plaqueteira do Instituto de Pesquisa em Saúde do Principado das Astúrias, ISPA. Que está localizada em Oviedo, Espanha.Olá.Eu sou Laura Guti

Research

JoVE Journal

Biology

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Células ES: Cultura A partir de células congeladas

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

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Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Isolamento de primárias Miofibroblastos de Mouse e tecido do cólon humano

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...