Name: immunophenotyping and cell sorting of human mks from human primary sources or differentiated in vitro from hematopoietic progenitors
Uploaded: 2021-08-07T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors at JoVE.com

Teknik destek için Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo ve Begoña García Méndez (HUCA) ve Paloma Cerezo, Almudena Payero ve María de la Poveda-Colomo'ya (HCSC) teşekkür ederiz. Bu çalışma, RYC bursu olan A.B.'ye Tıbbi Hibeler (Roche SP200221001) tarafından kısmen desteklendi (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve I+D 2017 hibesi (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, İspanya ve Fondos FEDER) L.G.'ye, severo Ochoa Grant 'e (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, İspanya) p.M.-B. ve A.A.-H'ye intramural doktora sonrası hibe 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA, Oviedo, İspanya). Reinier van der Linden'e bilgilerini (ve zamanını) paylaştığı için teşekkür ederiz, özellikle çok renkli etiketli antikor paneli karışımı ve tek renkli boncuk kontrolü hazırlığı hakkındaki bilge tavsiyeleri.

1964 Helsinki Bildirgesi uyarınca tam kan ve kemik iliği örnekleri alınarak işlendi. Kurumsal tıbbi etik komitemiz (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-) tarafından onaylanan bir çalışma dahilinde, bilinçli onay (ISPA) verildikten sonra sağlıklı donörlerden tam kan örnekleri alındı. Clínico San Carlos Hastanesi Hematoloji Bölümü'nde (HCSC) yönetilen hastaların kemik iliği aspirat atma materyalinden kemik iliği örnekleri alındı.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

<ol>
	<li>Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Mechanisms+That+Control+Platelet+Production.">Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production.</a> Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).</li><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Incredible+Journey:+From+Megakaryocyte+Development+To+Platelet+Formation.">The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation.</a> Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li><li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+Of+The+Demarcation+Membrane+System+(DMS)+In+Megakaryocytes.">Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li><li>Couldwell, G., Machlus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+Of+Megakaryopoiesis+And+Platelet+Production+During+Inflammation.">Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation.</a> Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).</li><li>Kosaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Platelet+Production+From+Mature+Megakaryocytes:+Does+Platelet+Release+Occur+Via+Proplatelets.">In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets.</a> International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).</li><li>Lefrancais, E., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+Biogenesis+In+The+Lung+Circulation.">Platelet Biogenesis In The Lung Circulation.</a> Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).</li><li>Nieswandt, B., Stritt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocyte+Rupture+For+Acute+Platelet+Needs.">Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs.</a> Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).</li><li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1alpha+Induces+Thrombopoiesis+Through+Megakaryocyte+Rupture+In+Response+To+Acute+Platelet+Needs.">IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs.</a> Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li><li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Biased+Stem+Cells+Reside+At+The+Apex+Of+The+Haematopoietic+Stem-Cell+Hierarchy.">Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li><li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Routes+Of+Lineage+Development+Reshape+The+Human+Blood+Hierarchy+Across+Ontogeny.">Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny.</a> Science. 351 (6269), 2116 (2016).</li><li>Yamamoto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Analysis+Unveils+Self-Renewing+Lineage-Restricted+Progenitors+Generated+Directly+From+Hematopoietic+Stem+Cells.">Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Human+Megakaryocyte+Development.">Decoding Human Megakaryocyte Development.</a> Cell Stem Cell. , (2020).</li><li>Meinders, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repercussion+Of+Megakaryocyte-Specific+Gata1+Loss+On+Megakaryopoiesis+And+The+Hematopoietic+Precursor+Compartment.">Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment.</a> Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).</li><li>Meinders, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sp1/Sp3+Transcription+Factors+Regulate+Hallmarks+Of+Megakaryocyte+Maturation+And+Platelet+Formation+And+Function.">Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function.</a> Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).</li><li>Salunkhe, V. P., Guti&#233;rrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Of+Megakaryocytes+From+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells.">Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells.</a> Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).</li><li>Choudry, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Characterization+Of+Human+Megakaryocyte+Polyploidization+And+Lineage+Commitment.">Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment.</a> Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).</li><li>Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Prospective+Isolation+Of+Viable,+High+Ploidy+Megakaryocytes+From+Adult+Murine+Bone+Marrow+By+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting.">The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting.</a> Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).</li><li>Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+Of+Human+Megakaryocytes+By+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting.">Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting.</a> Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).</li><li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+The+Quest+For+In+Vitro+Platelet+Production+By+Re-Tailoring+The+Concepts+Of+Megakaryocyte+Differentiation.">On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation.</a> Medicina. 56 (12), (2020).</li><li>Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Platelet+Production+For+Transfusion+Purposes:+Where+Are+We+Now.">In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now.</a> Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).</li><li>Butov, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Megakaryocyte+Culture+From+Human+Bone+Marrow+Aspirates+As+A+Research+And+Diagnostic+Tool.">In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool.</a> Platelets. , 1-8 (2020).</li><li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gold+Standard+Protocol+For+Human+Megakaryocyte+Culture+Based+On+The+Analysis+Of+1,500+Umbilical+Cord+Blood+Samples.">A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples.</a> Thrombosis And Haemostasis. , (2020).</li></ol>

Megakaryopoezisin akış sitometrisi ile incelenmesine odaklanan araştırmaların çoğu, bugüne kadar MK alt kümelerinin sadece soyunaözgü yüzey belirteçleri (cd42A/CD42B, CD41/CD61) kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıyken, daha önceki MK farklılaşma aşamaları kötü incelenmiştir. Bu makalede, insan megakaryopoezisinin kapsamlı bir akış sitometrisi nitelemesi ele almak için bir immünofenotipleme stratejisi gösteriyoruz. Genel olarak, megakaryopoezisin daha ayrıntılı bir şekilde in...

Megakaryositler (MKs), özellikle trombopoietin (TPO) hormonu tarafından düzenlenen megakaryopoezis adı verilen karmaşık bir sürecin ardından hematopoetik kök hücrelerden (HSC' ler) gelişir. Megakaryopoezis'in klasik görünümü, HSC'lerden, taahhüt edilen ataların ve öncü hücrelerin hiyerarşik aşamalarının ardışık olarak ardışık olarak hücresel yolculuğunu açıklar ve sonuçta olgun bir MK'ye yol açan. Olgunlaşma sırasında, MK'ler birden fazla endokatoz turu yaşar, trombosit üretimi için yeterli membran yüzeyi sağlayan karmaşık bir hücre içi sınır membran sistemi (DMS) geliştirir ve olguntrombositler1,2,3tarafından miras kalan farklı granüllerde bulunan faktörlerin bolluğunu verimli bir şekilde üretir ve paketler. Sonuç olarak, olgun MK'ler oldukça poliploid bir çekirdekle karakterize edilen büyük hücrelerdir (40-60 μm) (>64N'ye bile ulaşır). Son çalışmalar, HSC'lerin belirli fizyo-patolojik koşullara yanıt olarak geleneksel soy taahhüt kontrol noktalarını atlayarak MK'lere farklılık gösterdiği alternatif rotalar önermektedir4,5,6,7,8,9,10,11. Bu bulgular, olgun MK'ya karşı hematopoetik farklılaşmanın biyolojik ihtiyaçlara cevap veren sürekli ve uyarlanabilir bir süreç olduğunu vurgulamaktadır.
Hücre biyolojisi ve megakaryopoezis12'yikarakterize eden moleküler yönler hakkında artan bilgi ile, sürecin akış sitometrisi ile incelenmesine adanmış araştırmaların çoğu, olgun MK'lerin soyuna özgü yüzey belirteçleri (cd42A /B, CD41 / CD61) kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıdır, daha önceki MK farklılaşma aşamaları ise keşfedilmemiştir. Daha önce megakaryopoez'i fare kemik iliği ve kemik iliği türevi MK kültürlerinde sahneleme stratejisini belgeledik13,14, uyarladık ve insanlara uyguladık15. Bu yazıda megakaryopoezlerin karakterizasyonuna izin veren bir immünofenomipi stratejisi gösteriyoruz, HSC'lerden olgun MK'lere, insan birincil kaynaklarında (kemik iliği -BM- ve periferik kan -PB-) veya in vitro kültürlerde MK'ye özgü ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT ve CD71) entegre eden bir panel kullanarak. Büyük boyutuna ve kırılganlığına rağmen, MK'ler yukarıda belirtilen hücre yüzeyi belirteçleri kullanılarak immünofipotip edilebilir ve hücre yırtılmasını ve/veya hasarını en aza indirmek için belirli basınç ve nozül çapı koşullarında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile zenginleştirilebilir. Bu teknik, megakaryopoez ve trombosit üretiminin insan sağlığı ve hastalığındaki karmaşıklığını daha iyi anlamak amacıyla çoklu Omics yaklaşımlarını kolaylaştırır. Dikkat çekici, artan talebin klinik bağlamında tanı ve prognoza yardımcı olmak için yararlı bir araç olarak ortaya çıkacaktır.
Bu yazıda, birincil kaynaklardan MK'ya özgü ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini entegre eden veya in vitrooluşturulan bir panel ile insan megakaryopoezini sahneleme stratejisini belgeleyeceğiz. Ayrıca, floresanla etkinleştirilmiş bir hücre sıralayıcısı, tercih edilen kesirler ve olgun MK'ler ile sıralamak için bir protokol sağlıyoruz (Şekil 1). Bu adım popüler değildir, çünkü MK'lerin büyüklüğü ve kırılganlığı nedeniyle teknik olarak zordur. Bununla birlikte, daha önce hem fare hem de insan kemik iliği örneklerinde ve teknolojik ilerleme nedeniyle, her seferinde daha iyi bir sonuçla16,17,18. MK'lerin veya MK öncüllerinin çalışılabildiği insan birincil kaynakları arasında kemik iliği, kordon kanı ve periferik kan bulunur. Her numune üzerinde analiz için ilgili hücre fraksiyonunu izole etmek için uygun numune işleme önemlidir. Standart prosedürler, megakaryopoez çalışmasını hedeflerken dikkate alınması gereken bazı hususlarla dahil edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>130 micron Nozzle</td>
			<td>BD</td>
			<td>643943</td>
			<td>required for MK sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810R Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell isolation and washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-4-62 Swing Bucket Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell isolation and washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge</td>
			<td>ELITech Group</td>
			<td></td>
			<td>Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Galaxy 170 S</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Cell Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>To prepare cytospins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria IIu sorter</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Lasers 488-nm and 633-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX 41</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope BX 61</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoe Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Microphotographs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To obtain PBMCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4646</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#07801</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Erythropoietin (EPO)</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems</td>
			<td>287-TC-500</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human stem cell factor (SCF)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&#8482;</td>
			<td>PHC2115</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human thrombopoietin (TPO)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco&#8482;</td>
			<td>PHC9514</td>
			<td>or TPO receptor agonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>#09650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD CompBead Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td>BD</td>
			<td>552843</td>
			<td>Antibodies for human cells are generally from mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Accudrop Beads</td>
			<td>BD</td>
			<td>345249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 AF-647</td>
			<td>BD</td>
			<td>561654</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 FITC</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>31F-100T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>555821</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41 PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555467</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD41 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD</td>
			<td>333148</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42A APC</td>
			<td>Immunostep</td>
			<td>42AA-100T</td>
			<td>We observed unspecific binding... that needs to be assessed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42A PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>558819</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD42B PerCP</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303910</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49B PE</td>
			<td>BD</td>
			<td>555669</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD61 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>555753</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD71 APC-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>334109</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BD Fc Block</td>
			<td>BD</td>
			<td>564219</td>
			<td>Fc blocking - control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIT PE-Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>313212</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lineage Cocktail 2 FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>643397</td>
			<td>Mouse anti-human</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R6513</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-500</td>
			<td>Merck</td>
			<td>93443-500ML</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainers for sorting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrics Filters 100 micrometers</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2328</td>
			<td>Cell strainers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols&#160; - unless otherwise specified.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunophenotyping and cell sorting of human mks from human primary sources or differentiated in vitro from hematopoietic progenitors

Megakaryosit (MK) farklılaşması, yüksek poliploid (hatta >64N'ye) ve son derece büyük bir hücreye (40-60 μm) neden olan bir dizi endomitotik döngüyü kapsar. Hücre biyolojisi ve moleküler düzeyde megakaryopoeziste hızla artan bilginin aksine, megakaryopoezisin akış sitometrisi ile karakterizasyonu, olgun MK'lerin soyuna özgü yüzey belirteçleri kullanılarak tanımlanmasıyla sınırlıdır, daha önceki MK farklılaşma aşamaları ise keşfedilmemiştir. Burada, insan birincil kaynaklarında veya in vitro kültürlerde art arda gelen MK farklılaşma aşamalarının, MK spesifik ve spesifik olmayan yüzey belirteçlerini entegre eden bir panelle tanımlanmasını sağlayan bir immünofenomileme stratejisi sunuyoruz. Boyutuna ve kırılganlığına rağmen, MK'ler yukarıda belirtilen panel kullanılarak immünofenotipe edilebilir ve belirli basınç ve nozül çapı koşulları altında floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile zenginleştirilebilir. Bu yaklaşım, insanlarda megakaryopoez ve trombosit üretiminin karmaşıklığını daha iyi anlamak amacıyla çoklu Omics çalışmalarını kolaylaştırır. Megakaryopoezisin daha iyi nitelendirmesi, soyla ilgili patolojilerin ve malignitenin tanısında veya prognozunda temel teşkil edebilir.

Kemik İliği ve Ploidy Şekil 4'tehastalardan alınan BM örneklerinde (aspirasyon) megakaryopoezin temsili immünofenotiping analizini gösteriyoruz. Hücresel fraksiyonu CD71 ve CD31'e göre çizerken, altı ana popülasyonu eledik: CD31- CD71- (kırmızı), CD31- CD71+ (mavi), CD31+ CD71- (turuncu), CD31+ CD71orta (açık yeşil), CD31+ CD71+ ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors at JoVE.com

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Burada, megakaryosit farklılaşmasının karakterizasyonu için bir immünofenotyping stratejisi sunuyoruz ve bu stratejinin floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcısı ile megakaryositlerin farklı aşamalarda sıralanmasına nasıl izin verdiğini gösteriyoruz. Metodoloji insan birincil dokularına uygulanabilir, aynı zamanda kültür in vitroundaüretilen megakaryositlere de uygulanabilir.

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

Megakaryocyte (MK) differentiation encompasses a number of endomitotic cycles that result in a highly polyploid (reaching even&#160;&#62;64N) and ...

Merhaba.Ben Andrea Acebes Huerta.Asturias, ISPA Prensliği Sağlık Araştırma Enstitüsü'nün Platelet Araştırma Laboratuvarı'nda doktora sonrası araştırmacıyım. Oviedo, İspanya'da bulunan.Hello.I Laura Guti

Research

JoVE Journal

Biology

Immunophenotyping and Cell Sorting of Human MKs from Human Primary Sources or Differentiated In Vitro from Hematopoietic Progenitors

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Donmuş Hücreler itibaren Kültür: İnsan Embriyonik kök hücrelerin

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...