Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا موظفي علم المناعة السريرية في Monash Health على مساعدتهم في هذا العمل.

تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية في موناش هيلث. يتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية.
1. إعداد مستضد
ملاحظة: يمكن استخدام ثلاثة مستحضرات مستضدية مختلفة لتقييم الاستجابة المناعية ل Hi. هذه هي 1) مكون تحت خل...

<ol>
	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

تستخدم الطرق المذكورة هنا قياس التدفق الخلوي القائم على التألق وتقنيات الفحص المجهري متحد البؤر التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب للحصول على معلومات مفصلة حول استجابة الرئة الالتهابية ل Hi.
يعد إنشاء الصيغة المستضدية المناسبة ل Hi لاستخدامها أمرا بالغ الأهمية ، ومن المستحسن ...

المستدمية النزلية (Hi) هي بكتيريا متعايشة طبيعية موجودة في البلعوم لدى معظم البالغين الأصحاء. قد تحتوي Hi على كبسولة عديد السكاريد (الأنواع A-F ، على سبيل المثال ، النوع B أو HiB) أو تفتقر إلى كبسولة وتكون غير قابلة للكتابة (NTHi) 1. يبدأ استعمار الغشاء المخاطي بهذه البكتيريا في مرحلة الطفولة المبكرة ، وهناك دوران لسلالات استعمارية مختلفة2. هذه البكتيريا قادرة أيضا على غزو كل من الجهاز التنفسي العلوي والسفلي. في هذا السياق ، قد يحفز تنشيط الاستجابة المناعية والالتهاب 3,4. قد تسبب هذه الاستجابة الالتهابية مرضا سريريا وتساهم في مجموعة متنوعة من أمراض الجهاز التنفسي المهمة ، بما في ذلك التهاب الجيوب الأنفية والتهاب الأذن الوسطى والتهاب الشعب الهوائية والتليف الكيسي والالتهاب الرئوي ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). معظم هذه الحالات ناتجة عن سلالات NTHi2. سوف تصف هذه المقالة طرق تقييم الاستجابات المناعية التنفسية ل Hi باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر.
تم تكييف الطرق الموضحة أدناه من التقنيات الراسخة التي تم تعديلها لتقييم الاستجابة الالتهابية ل Hi. يعد اختيار شكل مستضد مناسب من Hi جزءا أساسيا من هذا التقييم. تتراوح المستحضرات المستضدية من مكونات جدار الخلية إلى البكتيريا الحية. لإنشاء وتوحيد المقايسات ، قد يكون استخدام عينات الدم المحيطية مفيدا جدا في البداية.
يتيح قياس التدفق الخلوي قياس مجموعة متنوعة من المعلمات والمقايسات الوظيفية من عينة واحدة على المستوى الخلوي. تتميز هذه التقنية بميزة أنه يمكن تقييم استجابات خلوية محددة (على سبيل المثال ، إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أو إنتاج السيتوكين داخل الخلايا) عند مقارنتها بطرق أخرى أكثر عمومية مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو ELISspot.
يتم التعبير عن الفخاخ خارج الخلية بواسطة العدلات (NETs)5،6،7 وبواسطة خلايا أخرى مثل الضامة (METs)8. يتم التعرف عليها بشكل متزايد كاستجابة التهابية رئيسية ، لا سيما في العدوى في الرئة9. يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. تسمح هذه التقنية بالتحديد النهائي لشبكات / METs وتميز تعبيرها عن الأشكال الأخرى لموت الخلايا6.
كل من قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر عبارة عن مقايسات قائمة على التألق. يعتمد نجاحها على بروتوكولات الإجهاد المثلى للعينات البيولوجية. تستغرق هذه الأساليب بعض الوقت للتعلم وتتطلب خبرة إشرافية مناسبة. الأدوات المعنية هي أيضا مكلفة على حد سواء لشراء وتشغيل. يشمل الإعداد الأمثل لاستخدامها الجامعات الكبرى ومستشفيات الإحالة من الدرجة الثالثة.
الطرق المستخدمة في هذا البروتوكول قابلة للنقل لدراسة الكائنات الحية المماثلة الأخرى المشاركة في أمراض الجهاز التنفسي (على سبيل المثال ، Moxarella catarrhalis والعقدية الرئوية). NTHi يتفاعل أيضا مع بكتيريا الجهاز التنفسي الشائعة الأخرى10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

المستدمية النزلية (Hi) هي بكتيريا منتشرة توجد في مجموعة من أمراض الجهاز التنفسي. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات / التقنيات المختلفة لتقييم الاستجابة المناعية التنفسية / الالتهابية لهذه البكتيريا. قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر هي تقنيات قائمة على التألق تسمح بالتوصيف التفصيلي للاستجابات البيولوجية. يمكن استخدام أشكال مختلفة من مستضد Hi ، بما في ذلك مكونات جدار الخلية ، والمستحضرات المقتولة / المعطلة ، والبكتيريا الحية. Hi هي بكتيريا شديدة الحساسية تتطلب وسائط مخصبة ولكن من السهل عموما أن تنمو في إعدادات المختبر القياسية. يمكن الحصول على عينات الأنسجة للتحفيز باستخدام Hi من الدم المحيطي أو تنظير القصبات أو الرئة المقطوعة (على سبيل المثال ، في المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لعلاج سرطان الرئة). يمكن تقييم وظيفة البلاعم والعدلات بشكل شامل باستخدام قياس التدفق الخلوي مع مجموعة متنوعة من المعلمات التي تم قياسها ، بما في ذلك البلعمة وأنواع الأكسجين التفاعلية وإنتاج السيتوكين داخل الخلايا. يمكن تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية (على سبيل المثال ، الخلية التائية ووظيفة الخلية القاتلة الطبيعية) على وجه التحديد باستخدام قياس التدفق الخلوي ، بشكل أساسي لإنتاج السيتوكين داخل الخلايا. عدوى Hi هي محفز قوي لإنتاج المصيدة خارج الخلية ، سواء عن طريق العدلات (NETs) أو الضامة (METs). يمكن القول إن الفحص المجهري متحد البؤر هو الطريقة المثلى لتقييم تعبير NET و MET ، والذي يمكن استخدامه أيضا لتقييم نشاط الأنزيم البروتيني. يمكن تقييم مناعة الرئة ضد المستدمية النزلية باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر.

تظهر النتائج التمثيلية كيف يمكن تقييم / قياس الاستجابات المناعية الالتهابية ل NTHi عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر. جزء رئيسي من تفسير النتائج هو المقارنة في التألق بين العينات الضابطة والمحفزة. عادة ما تكون هناك حاجة إلى عدد من التجارب الأولية لتحسين تلطيخ العينات. يعت...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

المستدمية النزلية تحفز الالتهاب في الجهاز التنفسي. ستركز هذه المقالة على استخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر لتحديد الاستجابات المناعية بواسطة الخلايا البلعمية والخلايا الليمفاوية استجابة لهذه البكتيريا.

تقييم الاستجابات المناعية التنفسية للمستدمية النزلية

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

المستدمية النزلية هي سبب رئيسي للالتهابات في مختلف أمراض الرئة المزمنة بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن والالتهاب الرئوي. يصف هذا البروتوكول طرق تقييم تأثير المستدمية على التهاب الرئة. مزايا هذه التقنية هي أنها تسمح بإجراء تقييم شامل للاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية.احتضان 450 ميكرولترا من الدم المحيطي مع 50 ميكرولترا من يوديد البروبيديوم المنشط المسمى H influenzae في أنبوب سعة خمسة ملليلتر لمدة 20 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. أخرج العينة من الحمام المائي ، وأضف خمسة ميكرولتر من DHR ودوامة لمدة 10 ثوان. ثم ضعه مرة أخرى في حمام مائي لمدة 10 دقائق أخرى.بعد إزالة العينة من حمام مائي ، قم بتحليل كريات الدم الحمراء بخمسة ملليلتر من محلول كلوريد الأمونيوم 0.8٪ وتحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في النص. قسم عينة الدم المحيطية إلى حصص للتحكم وتحفيز المستضد. أضف الأجسام المضادة المكلفة إلى كلتا العينتين.ثم أضف النزلة النزلية H غير القابلة للكتابة إلى عينة المستضد واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف عامل حجب Golgi brefeldin A إلى العينات واحتضانها لمدة خمس ساعات أخرى. بعد تحليل كريات الدم الحمراء كما هو موضح سابقا ، قم بإصلاح الكريات البيض باستخدام 500 ميكرولتر من واحد إلى 2٪ بارا فورمالدهايد لمدة ساعة واحدة.عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، ثم تخلل مليون خلية مع 100 ميكرولتر من الصابونين 0.1٪ لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بأجسام مضادة مناسبة تحمل علامة الفلورسنت. اغسل الخلايا ، ثم قم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.أوجد نسبة الخلايا المستجيبة لمولد الضد عن طريق الحصول على تجمعات الخلايا الليمفاوية ذات الصلة. قم بإجراء تلطيخ الخلفية على الخلايا غير المحفزة لجميع السيتوكينات المراد تحليلها. قم بتقطيع حوالي 20 إلى 40 جراما من عينة استئصال الفص إلى ثلاثة إلى خمسة أقسام ملليمترية مكعبة.ضعها داخل غرفة معقمة سعة 50 ميكرولتر وقم بتفتيت الأنسجة ميكانيكيا باستخدام أداة تجميع مناسبة. بعد تكسير الأنسجة ، قم بتحليل خلايا الدم الحمراء كما هو موضح وأعد تعليق الخلايا في RPMI المعقم. ثم قم بتصفية الخلايا من خلال شبكة نايلون معقمة 100 ميكرومتر وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد التريبان الأزرق.بالنسبة لفحص العدوى ، أعد تعليق خلايا الرئة في RPMI إلى تركيز نهائي يبلغ 4 ملايين خلية لكل ملليلتر لكل أنبوب. ثم تصيب الخلايا في MOI من 100 بكتيريا لكل خلية. قم بفك الغطاء نصف دوران للسماح بنقل الغاز في الأنابيب.ضع الخلايا في دوار الأنبوب واحتضنها عند 37 درجة مئوية أثناء الدوران عند 12 دورة في الدقيقة. بعد ساعة واحدة من التحفيز ، أضف grefeldin A لمنع تصدير السيتوكينات خارج الخلية واحتضان معلقات الخلايا لمدة 16 إلى 22 ساعة أخرى مع الدوران. في اليوم التالي ، اغسل معلق الخلية ب 500 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري و 0.01٪ أزيد الصوديوم.بعد ذلك ، قم بتلطيخ معلق الخلية لعلامات سطح خلية الخلايا الليمفاوية البشرية المحددة لمدة ساعة واحدة. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS وقم بإصلاحها واختراقها كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا لمدة ساعة واحدة.ثم اغسل الخلايا وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS قبل الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي. قياس التحلل البروتيني عن طريق عمل البروتينات المعدنية ، إضافة الفلوريسئين المسمى الركيزة الجيلاتين مباشرة على شرائح قسم أنسجة الرئة. ضع الشرائح أفقيا واحتضنها في غرفة مرطبة محمية بالضوء عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.لتحضير عناصر تحكم سلبية ، أضف مخزن مؤقت تفاعل × بدون جيلاتين فلوري إلى الأقسام لمزيد من التحليل. كانت خلايا الدم الطرفية أحادية النواة مسورة باستخدام مبعثرة للأمام والجانب لتحديد عدد الخلايا البلعمية. تم تعريف مجتمع الخلايا البلعمية أيضا من خلال تعبير CD14 لتسمية الخلايا الوحيدة.تم إجراء قياس ROS عن طريق أكسدة DHR 123 لإنتاج مضان. تمت مقارنة متوسط التألق للعينة المحفزة مع السيطرة. تم قياس إنتاج السيتوكين داخل الخلايا بواسطة الخلايا الليمفاوية باستخدام قياس التدفق الخلوي.تم تحليل الخلايا أولا لتعبيرها عن علامة الكريات البيض CD45 ثم للقرص المضغوط الثالث والقرص المضغوط الرابع ، القرص المضغوط الثامن. تم تقييم الخلايا الإيجابية CD الثلاثة و CD الأربعة لإنتاج السيتوكين داخل الخلايا في العينات الضابطة والمحفزة. تم قياس نشاط الأنزيم البروتيني بواسطة التصوير الزيموجرافي NC في أقسام أنسجة الرئة غير الثابتة.أشار تلطيخ الفلورسنت إلى وجود نشاط MMP ، والذي كان أيضا موضعيا مع التعبير عن الكروماتين. تتطلب إضافة الأجسام المضادة إلى عينات أنسجة الرئة التركيز وسيتطلب تلطيخ الخلايا تحسينا في التجارب الأولية. يمكن تحليل طافت عينات أنسجة الرئة بشكل أكبر للوسطاء الالتهابيين الآخرين باستخدام تقنيات مثل ELISA و يمكن استخدام هذه التقنيات لتقييم تأثير العلاجات المحتملة على التهاب الرئة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

انزيم مرتبط Immunospot الفحص (ELISPOT) : القياس الكمي للردود TH - 1 المناعة الخلوية ضد مولدات المضادات الجرثومية

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Seven Steps to Stellate Cells

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لقياس الاستجابات المناعية لمكافحة الملاريا في سياق الفيروس المسبب للإيدز

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

الإدارة داخل القصبة الهوائية لل<em&gt; المستدمية النزلية</em&gt; في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...