Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke personalet i klinisk immunologi hos Monash Health for deres hjælp med dette arbejde.

Dette arbejde blev godkendt af den humane videnskabsetiske komité for Monash Health. Protokollen følger retningslinjerne fra den humane videnskabsetiske komité.
1. Antigenpræparat
BEMÆRK: Tre forskellige antigene præparater kan bruges til at vurdere immunresponset på Hi. Disse er 1) en subcellulær komponent (typisk fra bakteriecellevæggen); 2) dræbte og inaktiverede bakterier; og 3) levende bakterier. Bestem brugen af hvert antigenpræparat inden indledninge...

<ol>
	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

De metoder, der er anført her, bruger fluorescensbaseret flowcytometri og konfokal mikroskopiteknikker, der kan bruges sammen for at få detaljerede oplysninger om det inflammatoriske lungerespons på Hi.
Etablering af den passende antigene formulering af Hi, der skal anvendes, er kritisk, og det er tilrådeligt at have specifikke input fra en mikrobiolog i denne henseende. Live Hi inducerer et stærkere svar, mens dræbte Hi-præparater og Hi-komponenter er mere standardiserede og er lettere...

Haemophilus influenzae (Hi) er en normal kommensal bakterie til stede i svælget hos de fleste raske voksne. Hej kan have en polysaccharidkapsel (type A-F, f.eks. type B eller HiB) eller mangle en kapsel og være ikke-typebar (NTHi)1. Kolonisering af slimhinden med denne bakterie begynder i den tidlige barndom, og der er en omsætning af forskellige koloniserende stammer2. Denne bakterie er også i stand til invasion af både øvre og nedre luftveje; I denne sammenhæng kan det fremkalde aktivering af immunresponset og inflammation 3,4. Denne inflammatoriske respons kan forårsage klinisk sygdom og bidrage til en række vigtige respiratoriske tilstande, herunder bihulebetændelse, otitis media, bronkitis, cystisk fibrose, lungebetændelse og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL). De fleste af disse forhold skyldes NTHi-stammer2. Denne artikel vil beskrive metoder til vurdering af respiratoriske immunresponser på Hi ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi.
Metoderne beskrevet nedenfor er blevet tilpasset fra veletablerede teknikker, der er blevet modificeret til at vurdere den inflammatoriske reaktion på Hi. Udvælgelsen af en passende antigenform af Hi er en vigtig del af denne vurdering. Antigene præparater spænder fra cellevægskomponenter til levende bakterier. For at etablere og standardisere assays kan brugen af perifere blodprøver være meget nyttigt i starten.
Flowcytometri muliggør måling af en række parametre og funktionelle assays fra en prøve på celleniveau. Denne teknik har den fordel, at specifikke cellulære reaktioner (f.eks. produktion af reaktive iltarter (ROS) eller intracellulær cytokinproduktion) kan vurderes sammenlignet med andre mere generelle metoder såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller ELISspot.
Ekstracellulære fælder udtrykkes af neutrofiler (NET'er)5,6,7 og af andre celler såsom makrofager (MET'er)8. De anerkendes i stigende grad som en vigtig inflammatorisk reaktion, især ved infektion i lungen9. De kan vurderes ved konfokal fluorescensmikroskopi. Denne teknik muliggør endelig identifikation af NET'er/MET'er og adskiller deres ekspression fra andre former for celledød6.
Både flowcytometri og konfokal mikroskopi er fluorescensbaserede assays. Deres succes er afhængig af optimale belastningsprotokoller for biologiske prøver. Disse metoder tager lidt tid at lære og kræver passende tilsynsekspertise. De involverede instrumenter er også dyre både at købe og køre. Den optimale ramme for deres anvendelse omfatter større universiteter og tertiære henvisningshospitaler.
De metoder, der anvendes i denne protokol, kan overføres til undersøgelse af andre lignende organismer, der er involveret i luftvejssygdomme (f.eks. Moxarella catarrhalis og Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerer også med andre almindelige åndedrætsbakterier10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) er en udbredt bakterie, der findes i en række luftvejssygdomme. En række forskellige assays / teknikker kan anvendes til at vurdere respiratorisk immun / inflammatorisk respons på denne bakterie. Flowcytometri og konfokal mikroskopi er fluorescensbaserede teknologier, der muliggør detaljeret karakterisering af biologiske reaktioner. Forskellige former for Hi-antigen kan anvendes, herunder cellevægskomponenter, dræbte / inaktiverede præparater og levende bakterier. Hej er en kræsen bakterie, der kræver berigede medier, men er generelt let at dyrke i standard laboratorieindstillinger. Vævsprøver til stimulering med Hi kan fås fra perifert blod, bronkoskopi eller resekteret lunge (f.eks. Hos patienter, der gennemgår kirurgi til behandling af lungekræft). Makrofag og neutrofilfunktion kan vurderes grundigt ved hjælp af flowcytometri med en række parametre målt, herunder fagocytose, reaktive iltarter og intracellulær cytokinproduktion. Lymfocytfunktion (f.eks. T-celle- og NK-cellefunktion) kan vurderes specifikt ved hjælp af flowcytometri, hovedsageligt til intracellulær cytokinproduktion. Hi-infektion er en potent inducer af ekstracellulær fældeproduktion, både af neutrofiler (NET'er) og makrofager (MET'er). Konfokal mikroskopi er uden tvivl den mest optimale måde at vurdere NET- og MET-ekspression på, som også kan bruges til at vurdere proteaseaktivitet. Lungeimmunitet over for Haemophilus influenzae kan vurderes ved hjælp af flowcytometri og konfokal mikroskopi.

De repræsentative resultater viser, hvordan inflammatoriske immunresponser på NTHi kan vurderes / kvantificeres ved flowcytometri og konfokal mikroskopi. En vigtig del af fortolkningen af resultaterne er sammenligningen i fluorescens mellem kontrolprøver og stimulerede prøver. En række indledende eksperimenter er normalt nødvendige for at optimere farvningen af prøver. Hvor mange forskellige farver, der kan undersøges samtidigt, afhænger af antallet af kanaler, der er tilgængelige på flowcytometeret/konfokalmi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae inducerer betændelse i luftvejene. Denne artikel vil fokusere på brugen af flowcytometri og konfokal mikroskopi til at definere immunrespons af fagocytter og lymfocytter som reaktion på denne bakterie.

Vurdering af respiratoriske immunresponser på Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influenza er en væsentlig årsag til betændelse i forskellige kroniske lungesygdomme, herunder KOL og lungebetændelse. Denne protokol beskriver metoder til vurdering af virkningen af haemophilus på lungebetændelse. Fordelene ved denne teknik er, at den giver mulighed for en omfattende vurdering af medfødte og adaptive immunresponser.Inkuber 450 mikroliter perifert blod med 50 mikroliter af et aktiveret propidiumiodid mærket H influenzae i et fem milliliter rør i 20 minutter i et vandbad ved 37 grader Celsius. Fjern prøven fra vandbadet, tilsæt fem mikroliter DHR og hvirvel i 10 sekunder. Læg det derefter tilbage i vandbadet i yderligere 10 minutter.Efter fjernelse af prøven fra vandbadet lyseres erythrocytterne med fem milliliter 0,8% ammoniumchloridopløsning og prøverne analyseres på et flowcytometer som beskrevet i teksten. Opdel den perifere blodprøve i alikvoter til kontrol og antigenstimulering. Tilsæt costimulatoriske antistoffer til begge prøver.Derefter tilsættes den ikke-typable H-influenzae til antigenprøven og inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i en time. Derefter tilsættes Golgi-blokeringsmidlet brefeldin A til prøverne og inkuberes dem i yderligere fem timer. Efter lysning af erythrocytterne som tidligere demonstreret, fastgøres leukocytterne ved hjælp af 500 mikroliter en til 2% paraformaldehyd i en time.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og gennemtræng derefter 1 million celler med 100 mikroliter 0,1% saponin i 15 minutter. Inkuber derefter cellerne med passende fluorescerende mærkede antistoffer. Vask cellerne, og analyser dem derefter ved hjælp af et flowcytometer.Bestem andelen af antigenresponsceller ved at få de relevante lymfocytpopulationer. Udfør baggrundsfarvning på ikke-stimulerede celler for alle cytokiner, der skal analyseres. Skær ca. 20 til 40 gram af lobectomiprøven i tre til fem kubikmillimeter sektioner.Placer dem inde i et sterilt 50 mikroliter kammer og fragmenter vævet mekanisk ved hjælp af en passende dis-aggregator. Efter vævsopdeling lyser de røde blodlegemer som demonstreret og resuspenderer cellerne i steril RPMI. Filtrer derefter cellerne gennem et 100 mikrometer sterilt nylonnet og tæl de levedygtige celler ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode.Til infektionsanalysen skal lungecellerne i RPMI resuspenderes til en endelig koncentration på 4 millioner celler pr. milliliter pr. Rør. Inficere derefter cellerne ved en MOI på 100 bakterier pr. Celle. Løsn hætten en halv rotation for at tillade gasoverførsel i rørene.Placer cellerne i rørrotatoren og inkuber dem ved 37 grader Celsius, mens de roterer ved 12 o / min. En time efter stimulering tilsættes grefeldin A for at forhindre ekstracellulær eksport af cytokiner og inkubere cellesuspensionerne i yderligere 16 til 22 timer med rotation. Den følgende dag vaskes cellesuspensionen med 500 mikroliter PBS indeholdende 1% bovin serumalbumin og 0,01% natriumazid.Derefter farves cellesuspensionen for specifikke humane lymfocytter celleoverflademarkører i en time. Vask derefter cellerne med PBS og fix og gennemtrængelig dem som vist tidligere. Derefter inkuberes cellerne med intracellulære cytokinfarvningsantistoffer i en time.Vask derefter cellerne og suspender dem i 100 mikroliter PBS før dataindsamling på et flowcytometer. Mål proteolyse via virkningen af metalloproteinaser, tilsæt fluoresceinmærket gelatinesubstrat direkte på lungevævssektionens dias. Placer diasene vandret og inkuber dem i et lysbeskyttet befugtet kammer ved 37 grader Celsius i en time.For at forberede negative kontroller tilsættes en x-reaktionsbuffer uden fluorescerende gelatine til sektionerne til yderligere analyse. Perifere blodmononukleære celler blev indhegnet ved hjælp af fremad og side spredt for at definere fagocytpopulationen. Fagocytpopulationen blev yderligere defineret ved CD14-ekspression for at mærke monocytterne.ROS-måling blev udført via oxidation af DHR 123 for at producere fluorescens. Medianfluorescensen af den stimulerede prøve blev sammenlignet med kontrollen. Intracellulær cytokinproduktion af lymfocytter blev målt ved anvendelse af flowcytometri.Celler blev analyseret først for deres ekspression af leukocytmarkøren CD45 og derefter for CD tre og CD fire, CD otte. CD tre, CD fire positive celler blev vurderet til intracellulær cytokinproduktion i kontrol og stimulerede prøver. Proteaseaktivitet blev målt ved NC to zymografi i ikke-fikserede lungevævsafsnit.Fluorescerende farvning indikerede tilstedeværelsen af MMP-aktivitet, som også var co-lokaliseret med ekspressionen af kromatin. Tilsætning af antistoffer til lungevævsprøverne kræver koncentration, og farvning af cellerne vil kræve optimering i indledende forsøg. Supernatanten af lungevævsprøverne kan analyseres yderligere for andre inflammatoriske mediatorer ved hjælp af teknikker som ELISA, og disse teknikker kan bruges til at vurdere effekten af potentielle terapier på lungebetændelse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In vitro</em&gt; Model til måling immunresponser på malaria i forbindelse med hiv co-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratrakeal administration<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musemodeller at studere Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Brug zebrafisk modeller af human influenza A-virus infektioner at Screen antivirale lægemidler og karakterisere værtsimmunsystem Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...