Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
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Die Autoren danken den Mitarbeitern der Klinischen Immunologie von Monash Health für ihre Unterstützung bei dieser Arbeit.

Diese Arbeit wurde von der Ethikkommission für menschliche Forschung von Monash Health genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung.
1. Antigene Zubereitung
HINWEIS: Drei verschiedene Antigenpräparate können verwendet werden, um die Immunantwort auf Hi zu beurteilen. Diese sind 1) eine subzelluläre Komponente (typischerweise von der bakteriellen Zellwand); 2) abgetötete und inaktivierte Bakterien; und 3) lebende Bakterien...

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	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. 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Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

Die hier aufgeführten Methoden verwenden fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopietechniken, die in Verbindung verwendet werden können, um detaillierte Informationen über die entzündliche Lungenantwort auf Hi zu erhalten.
Die Festlegung der geeigneten Antigenformulierung von Hi ist von entscheidender Bedeutung, und es ist ratsam, diesbezüglich spezifische Beiträge von einem Mikrobiologen zu erhalten. Live Hi induziert eine stärkere Reaktion, während abgetötete...

Haemophilus influenzae (Hi) ist ein normales kommensales Bakterium, das im Rachen der meisten gesunden Erwachsenen vorkommt. Hi kann eine Polysaccharidkapsel haben (Typ A-F, z. B. Typ B oder HiB) oder keine Kapsel haben und nicht typisierbar sein (NTHi)1. Die Besiedlung der Schleimhaut mit diesem Bakterium beginnt in der frühen Kindheit, und es gibt einen Umsatz verschiedener kolonisierender Stämme2. Dieses Bakterium ist auch in der Lage, sowohl in die oberen als auch in die unteren Atemwege einzudringen; In diesem Zusammenhang kann es eine Aktivierung der Immunantwort und Entzündung induzieren 3,4. Diese Entzündungsreaktion kann klinische Erkrankungen verursachen und zu einer Vielzahl wichtiger Atemwegserkrankungen beitragen, darunter Sinusitis, Mittelohrentzündung, Bronchitis, Mukoviszidose, Lungenentzündung und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Die meisten dieser Bedingungen sind auf NTHi-Stämmezurückzuführen 2. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Hi mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie.
Die unten beschriebenen Methoden wurden von etablierten Techniken adaptiert, die modifiziert wurden, um die Entzündungsreaktion auf Hi zu beurteilen. Die Auswahl einer geeigneten antigenen Form von Hi ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Bewertung. Antigene Präparate reichen von Zellwandbestandteilen bis hin zu lebenden Bakterien. Um Assays zu etablieren und zu standardisieren, kann die Verwendung von peripheren Blutproben zunächst sehr hilfreich sein.
Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Messung einer Vielzahl von Parametern und funktionellen Assays aus einer Probe auf zellulärer Ebene. Diese Technik hat den Vorteil, dass spezifische zelluläre Reaktionen (z. B. Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder intrazelluläre Zytokinproduktion) im Vergleich zu anderen allgemeineren Methoden wie Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder ELISspot bewertet werden können.
Extrazelluläre Fallen werden durch Neutrophile (NETs)5,6,7 und durch andere Zellen wie Makrophagen (METs)8 exprimiert. Sie werden zunehmend als eine wichtige Entzündungsreaktion erkannt, insbesondere bei Infektionen in der Lunge9. Sie können durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden. Diese Technik ermöglicht die definitive Identifizierung von NETs/METs und unterscheidet ihre Expression von anderen Formen desZelltods 6.
Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die konfokale Mikroskopie sind fluoreszenzbasierte Assays. Ihr Erfolg hängt von optimalen Belastungsprotokollen biologischer Proben ab. Diese Methoden brauchen einige Zeit, um zu erlernen und erfordern entsprechende Aufsichtskenntnisse. Die beteiligten Instrumente sind auch teuer in der Anschaffung und im Betrieb. Der optimale Rahmen für ihren Einsatz sind große Universitäten und tertiäre Überweisungskrankenhäuser.
Die in diesem Protokoll verwendeten Methoden sind übertragbar auf die Untersuchung anderer ähnlicher Organismen, die an Atemwegserkrankungen beteiligt sind (z. B. Moxarella catarrhalis und Streptococcus pneumoniae). NTHi interagiert auch mit anderen häufigen Atemwegsbakterien10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) ist ein weit verbreitetes Bakterium, das bei einer Reihe von Atemwegserkrankungen vorkommt. Eine Vielzahl verschiedener Assays / Techniken kann verwendet werden, um die respiratorische Immun- / Entzündungsreaktion auf dieses Bakterium zu beurteilen. Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie sind fluoreszenzbasierte Technologien, die eine detaillierte Charakterisierung biologischer Reaktionen ermöglichen. Verschiedene Formen von Hi-Antigen können verwendet werden, einschließlich Zellwandkomponenten, abgetötete / inaktivierte Präparate und lebende Bakterien. Hi ist ein anspruchsvolles Bakterium, das angereicherte Medien benötigt, aber im Allgemeinen in Standardlaborumgebungen leicht zu züchten ist. Gewebeproben zur Stimulation mit Hi können aus peripherem Blut, Bronchoskopie oder resezierter Lunge gewonnen werden (z. B. bei Patienten, die sich einer Operation zur Behandlung von Lungenkrebs unterziehen). Die Funktion von Makrophagen und Neutrophilen kann mittels Durchflusszytometrie umfassend beurteilt werden, wobei eine Vielzahl von Parametern gemessen wird, einschließlich Phagozytose, reaktiver Sauerstoffspezies und intrazellulärer Zytokinproduktion. Die Lymphozytenfunktion (z. B. T-Zell- und NK-Zellfunktion) kann mittels Durchflusszytometrie spezifisch beurteilt werden, hauptsächlich für die intrazelluläre Zytokinproduktion. Hi-Infektion ist ein potenter Induktor der extrazellulären Fallenproduktion, sowohl durch Neutrophile (NETs) als auch durch Makrophagen (METs). Die konfokale Mikroskopie ist wohl der optimalste Weg, um die NET- und MET-Expression zu beurteilen, die auch zur Beurteilung der Proteaseaktivität verwendet werden kann. Die Lungenimmunität gegen Haemophilus influenzae kann mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie beurteilt werden.

Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie entzündliche Immunantworten auf NTHi mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie beurteilt/quantifiziert werden können. Ein wichtiger Teil der Interpretation der Ergebnisse ist der Vergleich der Fluoreszenz zwischen Kontroll- und stimulierten Proben. Eine Reihe von Vorversuchen ist in der Regel erforderlich, um die Färbung von Proben zu optimieren. Wie viele verschiedene Farben gleichzeitig untersucht werden können, hängt von der Anzahl der Kanäle ab, die auf ...

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Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induziert Entzündungen in den Atemwegen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie, um Immunantworten von Phagozyten und Lymphozyten als Reaktion auf dieses Bakterium zu definieren.

Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influenza ist eine Hauptursache für Entzündungen bei verschiedenen chronischen Lungenerkrankungen wie COPD und Lungenentzündung. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Beurteilung der Wirkung von Hämophilus auf Lungenentzündungen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine umfassende Beurteilung der angeborenen und adaptiven Immunantwort ermöglicht.450 Mikroliter peripheres Blut mit 50 Mikrolitern eines aktivierten Propidiumiodids mit der Bezeichnung H influenzae in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen für 20 Minuten in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nehmen Sie die Probe aus dem Wasserbad, fügen Sie fünf Mikroliter DHR und Wirbel für 10 Sekunden hinzu. Dann legen Sie es für weitere 10 Minuten wieder in das Wasserbad.Nach der Entnahme der Probe aus dem Wasserbad lysieren Sie die Erythrozyten mit fünf Milliliter 0,8% Ammoniumchloridlösung und analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer, wie im Text beschrieben. Teilen Sie die periphere Blutprobe zur Kontrolle und Antigenstimulation in Aliquots auf. Fügen Sie beiden Proben kostimulatorische Antikörper hinzu.Dann das nicht typisierbare H influenzae in die Antigenprobe geben und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde inkubieren. Als nächstes fügen Sie das Golgi-Blockmittel Brefeldin A zu den Proben hinzu und inkubieren sie für weitere fünf Stunden. Nach dem Lysieren der Erythrozyten, wie zuvor gezeigt, fixieren Sie die Leukozyten mit 500 Mikrolitern von einem bis 2% Para-Formaldehyd für eine Stunde.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und permeabilisieren Sie dann 1 Million Zellen mit 100 Mikrolitern 0,1% Saponin für 15 Minuten. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit geeigneten fluoreszierenden markierten Antikörpern. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie dann mit einem Durchflusszytometer.Bestimmen Sie den Anteil der antigenreagierenden Zellen, indem Sie die relevanten Lymphozytenpopulationen erhalten. Führen Sie eine Hintergrundfärbung an nicht stimulierten Zellen durch, damit alle zu analysierenden Zytokine analysiert werden können. Schneiden Sie etwa 20 bis 40 Gramm der Lobektomieprobe in drei bis fünf Kubikmillimeterabschnitte.Legen Sie sie in eine sterile 50-Mikroliter-Kammer und fragmentieren Sie das Gewebe mechanisch mit einem geeigneten Disaggregator. Nach der Gewebedisaggregation lysieren Sie die roten Blutkörperchen wie gezeigt und resuspendieren Sie die Zellen in sterilem RPMI. Dann filtern Sie die Zellen durch ein 100 Mikrometer steriles Nylonnetz und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.Für den Infektionstest resuspendieren Sie die Lungenzellen in RPMI auf eine Endkonzentration von 4 Millionen Zellen pro Milliliter pro Röhrchen. Dann infizieren Sie die Zellen bei einem MOI von 100 Bakterien pro Zelle. Lösen Sie die Kappe eine halbe Umdrehung, um den Gastransfer in den Rohren zu ermöglichen.Legen Sie die Zellen in den Röhrchenrotator und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius, während sie sich mit 12 U/min drehen. Eine Stunde nach der Stimulation Grefeldin A hinzufügen, um den extrazellulären Export von Zytokinen zu verhindern, und die Zellsuspensionen für weitere 16 bis 22 Stunden mit Rotation inkubieren. Am nächsten Tag wird die Zellsuspension mit 500 Mikrolitern PBS gewaschen, das 1% Rinderserumalbumin und 0,01% Natriumazid enthält.Als nächstes färben Sie die Zellsuspension für spezifische menschliche Lymphozyten Zelloberflächenmarker für eine Stunde. Dann waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren und permeabilisieren Sie sie, wie zuvor gezeigt. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit intrazellulären Zytokin-Färbe-Antikörpern für eine Stunde.Dann waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in 100 Mikroliter PBS, bevor Sie die Daten auf einem Durchflusszytometer erfassen. Messen Sie die Proteolyse über die Wirkung von Metalloproteinasen, fügen Sie fluoresceinmarkiertes Gelatinesubstrat direkt auf die Objektträger des Lungengewebeabschnitts hinzu. Legen Sie die Objektträger horizontal auf und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einer lichtgeschützten Befeuchtungskammer bei 37 Grad Celsius.Um Negativkontrollen vorzubereiten, fügen Sie den Abschnitten einen x Reaktionspuffer ohne fluoreszierende Gelatine zur weiteren Analyse hinzu. Periphere mononukleäre Blutzellen wurden mit Vorwärts- und Seitenstreuung umgated, um die Phagozytenpopulation zu definieren. Die Phagozytenpopulation wurde weiter durch CD14-Expression definiert, um die Monozyten zu markieren.Die ROS-Messung wurde durch Oxidation von DHR 123 durchgeführt, um Fluoreszenz zu erzeugen. Die mediane Fluoreszenz der stimulierten Probe wurde mit der Kontrolle verglichen. Die intrazelluläre Zytokinproduktion durch Lymphozyten wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen.Die Zellen wurden zuerst auf ihre Expression des Leukozytenmarkers CD45 und dann auf CD drei und CD vier, CD acht analysiert. Die CD drei, CD vier positiven Zellen wurden auf intrazelluläre Zytokinproduktion in Kontroll- und stimulierten Proben untersucht. Die Proteaseaktivität wurde mittels NC-Zwei-Zymographie in nicht fixierten Lungengewebeschnitten gemessen.Fluoreszierende Färbung zeigte das Vorhandensein von MMP-Aktivität an, die auch mit der Expression von Chromatin kolokalisiert war. Die Zugabe von Antikörpern zu den Lungengewebeproben erfordert eine Konzentration und die Färbung der Zellen erfordert eine Optimierung in Vorexperimenten. Der Überstand der Lungengewebeproben kann mit Techniken wie ELISA und Diese Techniken können verwendet werden, um die Wirkung potenzieller Therapien auf Lungenentzündungen zu beurteilen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Messung der Immunantwort auf Malaria im Kontext der HIV-Koinfektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...