Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
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저자는 이 작업에 도움을 준 Monash Health의 임상 면역학 직원에게 감사드립니다.

이 연구는 Monash Health의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 항원 제제
참고: Hi에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 세 가지 다른 항원 제제를 사용할 수 있습니다. 이들은 1) 세포하 성분 (전형적으로 박테리아 세포벽으로부터); 2) 사멸 및 불활성화 박테리아; 3) 살아있는 박테리아. 임의의 ?...

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	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

여기에 나열된 방법은 Hi에 대한 염증성 폐 반응에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 함께 사용할 수 있는 형광 기반 유동 세포분석 및 공초점 현미경 기술을 사용합니다.
사용되는 Hi의 적절한 항원 제형을 확립하는 것이 중요하며, 이와 관련하여 미생물학자로부터 구체적인 의견을 듣는 것이 좋습니다. Live Hi는 더 강한 반응을 유도하는 반면, 사멸 Hi 제제 및 Hi 구성 요소는 더 표...

헤모필루스 인플루엔자(Hi)는 대부분의 건강한 성인의 인두에 존재하는 정상적인 공생 박테리아입니다. 다당류 캡슐 (유형 A-F, 예를 들어, 유형 B 또는 HiB)을 갖거나 캡슐이 결여되어 있고 비유형 (NTHi)1일 수 있다. 이 박테리아에 의한 점막의 식민지화는 어린 시절부터 시작되며, 다른 식민지 균주의 회전율이 있습니다2. 이 박테리아는 또한 상부 및 하부 호흡기 모두를 침범 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 면역 반응및 염증 3,4의 활성화를 유도할 수 있다. 이 염증 반응은 임상 질환을 유발할 수 있으며 부비동염, 중이염, 기관지염, 낭포 성 섬유증, 폐렴 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함한 다양한 중요한 호흡기 상태에 기여할 수 있습니다. 이러한 조건의 대부분은 NTHi 균주2로 인한 것입니다. 이 기사에서는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 Hi에 대한 호흡기 면역 반응을 평가하는 방법을 설명합니다.
하기에 기술된 방법들은 Hi에 대한 염증 반응을 평가하기 위해 변형된 잘 확립된 기술로부터 적응되었다. Hi의 적절한 항원 형태의 선택은 이러한 평가의 핵심 부분이다. 항원 제제는 세포벽 구성 요소에서 살아있는 박테리아에 이르기까지 다양합니다. 분석을 확립하고 표준화하기 위해 말초 혈액 샘플을 사용하는 것이 초기에 매우 도움이 될 수 있습니다.
유세포분석은 세포 수준에서 하나의 샘플에서 다양한 파라미터 및 기능 분석을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 또는 ELISspot과 같은 다른보다 일반적인 방법과 비교할 때 특정 세포 반응 (예 : 활성 산소 종 (ROS) 또는 세포 내 사이토 카인 생산)을 평가할 수 있다는 장점이 있습니다.
세포외 트랩은 호중구(NET)5,6,7 및 대식세포(MET)와 같은 다른 세포에 의해 발현됩니다.8. 그들은 특히 폐 9의 감염에서 주요 염증 반응으로 점점 더 인식되고있습니다. 이들은 컨포칼 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다. 이 기술은 NET/MET의 명확한 식별을 가능하게 하고 그 발현을 다른 형태의 세포 사멸과 구별합니다6.
유세포분석과 컨포칼 현미경은 모두 형광 기반 분석법입니다. 그들의 성공은 생물학적 샘플의 최적 변형 프로토콜에 달려 있습니다. 이러한 방법은 배우는 데 시간이 걸리며 적절한 감독 전문 지식이 필요합니다. 관련된 악기는 구매 및 운영 비용이 모두 비쌉니다. 그들의 사용을위한 최적의 설정은 주요 대학 및 3 차 위탁 병원을 포함합니다.
이 프로토콜에 사용 된 방법은 호흡기 질환과 관련된 다른 유사한 유기체 (예 : Moxarella catarrhalis 및 Streptococcus pneumoniae)의 연구를 위해 양도 할 수 있습니다. NTHi는 또한 다른 일반적인 호흡기 박테리아10과 상호 작용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

헤모필루스 인플루엔자 (Hi)는 다양한 호흡기 질환에서 발견되는 널리 퍼진 박테리아입니다. 이 박테리아에 대한 호흡 면역/염증 반응을 평가하기 위해 다양한 분석/기술을 사용할 수 있습니다. 유세포분석 및 컨포칼 현미경은 생물학적 반응의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 형광 기반 기술입니다. 세포벽 성분, 사멸/불활성화 제제 및 살아있는 박테리아를 포함한 다양한 형태의 Hi 항원을 사용할 수 있습니다. Hi는 농축 배지가 필요한 까다로운 박테리아이지만 일반적으로 표준 실험실 환경에서 쉽게 자랄 수 있습니다. 히히로 자극하기 위한 조직 샘플은 말초 혈액, 기관지 내시경 검사, 또는 절제된 폐 (예를 들어, 폐암의 치료를 위해 수술을 받는 환자에서)로부터 수득될 수 있다. 대식세포 및 호중구 기능은 식균작용, 활성 산소 종 및 세포내 사이토카인 생산을 포함하는 측정된 다양한 파라미터와 함께 유세포분석을 사용하여 포괄적으로 평가될 수 있다. 림프구 기능 (예를 들어, T 세포 및 NK 세포 기능)은 주로 세포내 시토카인 생산을 위해 유동 세포측정을 사용하여 특이적으로 평가될 수 있다. Hi 감염은 호중구 (NET)와 대 식세포 (MET) 모두에 의한 세포 외 트랩 생성의 강력한 유도제입니다. 컨포칼 현미경은 틀림없이 NET 및 MET 발현을 평가하는 가장 최적의 방법이며, 이는 프로테아제 활성을 평가하는 데에도 사용될 수 있습니다. 헤모필루스 인플루엔자에 대한 폐 면역은 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다.

대표적인 결과는 NTHi에 대한 염증성 면역 반응이 유세포 분석 및 공초점 현미경으로 어떻게 평가 / 정량화 될 수 있는지 보여줍니다. 결과 해석의 핵심 부분은 대조군과 자극 샘플 간의 형광 비교입니다. 일반적으로 샘플의 염색을 최적화하기 위해 많은 예비 실험이 필요합니다. 동시에 검사할 수 있는 색상의 수는 유세포분석기/컨포칼 현미경에서 사용할 수 있는 채널 수에 따라 다릅니다. 폐 단?...

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Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

헤모필루스 인플루엔자는 호흡기에서 염증을 유발합니다. 이 기사에서는 이 박테리아에 대한 반응으로 식세포와 림프구에 의한 면역 반응을 정의하기 위해 유세포분석 및 컨포칼 현미경을 사용하는 방법에 중점을 둘 것입니다.

헤모필루스 인플루엔자에 대한 호흡기 면역 반응 평가

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

헤모필루스 인플루엔자는 COPD 및 폐렴을 포함한 다양한 만성 폐 질환에서 염증의 주요 원인입니다. 이 프로토콜은 폐 염증에 대한 헤모필루스의 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 선천성 및 적응성 면역 반응을 포괄적으로 평가할 수 있다는 것입니다.450 마이크로 리터의 말초 혈액을 50 마이크로 리터의 활성화 된 요오드화 프로피듐 표지 H 인플루엔자를 섭씨 37 도의 수조에서 20 분 동안 5 밀리리터 튜브에 배양합니다. 수조에서 샘플을 제거하고 5 마이크로 리터의 DHR을 첨가하고 10 초 동안 와동시킵니다. 그런 다음 수조에 다시 10 분 더 두십시오.수조에서 샘플을 제거한 후 적혈구를 0.8 % 염화 암모늄 용액 5 밀리리터로 용해하고 텍스트에 설명 된대로 유세포 분석기에서 샘플을 분석합니다. 말초 혈액 샘플을 대조군 및 항원 자극을 위한 분취량으로 나눕니다. 두 샘플 모두에 공동자극항체를 추가합니다.그런 다음 항원 샘플에 비유형 H 인플루엔자를 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 골지 차단제 브레펠딘 A를 샘플에 첨가하고 5시간 더 배양한다. 이전에 입증된 바와 같이 적혈구를 용해시킨 후 1시간 동안 1 내지 2%파라-포름알데히드의 500마이크로리터를 사용하여 백혈구를 고정합니다.혈구계를 사용하여 세포를 세고 100 마이크로 리터의 0.1 % 사포닌으로 15 분 동안 100 만 개의 세포를 투과시킵니다. 다음으로, 세포를 적절한 형광 표지된 항체로 배양한다. 세포를 씻은 다음 유세포 분석기를 사용하여 분석하십시오.관련 림프구 집단을 얻어 항원 반응 세포의 비율을 결정한다. 분석할 모든 사이토카인에 대해 자극되지 않은 세포에 대한 배경 염색을 수행합니다. 약 20-40 그램의 폐엽 절제술 샘플을 3-5 입방 밀리미터 섹션으로 자릅니다.멸균 된 50 마이크로 리터 챔버 안에 넣고 적절한 디 애그리 게이터를 사용하여 조직을 기계적으로 단편화합니다. 조직 분해 후, 입증된 바와 같이 적혈구를 용해시키고 멸균 RPMI에 세포를 재현탁시킨다. 그런 다음 100 마이크로미터 멸균 나일론 메쉬를 통해 세포를 여과하고 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.감염 분석을 위해 RPMI의 폐 세포를 튜브당 밀리리터당 4백만 세포의 최종 농도로 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포당 100개의 박테리아의 MOI로 세포를 감염시킵니다. 튜브에서 가스가 전달될 수 있도록 캡을 반 바퀴 풉니다.세포를 튜브 회전 장치에 넣고 12RPM으로 회전하면서 섭씨 37도에서 배양합니다. 자극 1시간 후, 사이토카인의 세포외 수출을 방지하기 위해 그레펠딘 A를 첨가하고, 세포 현탁액을 회전과 함께 추가로 16 내지 22시간 동안 배양한다. 다음날, 1% 소 혈청 알부민과 0.01% 아지드화 나트륨을 함유하는 500마이크로리터의 PBS로 세포 현탁액을 세척한다.다음으로, 특정 인간 림프구 세포 표면 마커에 대한 세포 현탁액을 1시간 동안 염색한다. 그런 다음 PBS로 세포를 씻고 이전에 시연 한대로 고정하고 투과시킵니다. 다음으로, 세포를 세포내 사이토카인 염색 항체와 함께 1시간 동안 배양한다.그런 다음 세포를 세척하고 유세포 분석기에서 데이터를 수집하기 전에 100 마이크로 리터의 PBS에 재현 탁시킵니다. 금속 단백 분해 효소의 작용을 통해 단백질 분해를 측정하고 폐 조직 섹션 슬라이드에 직접 플루오레세인 표지 젤라틴 기질을 추가합니다. 슬라이드를 수평으로 놓고 섭씨 37도의 빛으로 보호된 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.음성 대조군을 준비하려면 추가 분석을 위해 형광 젤라틴이 없는 하나의 x 반응 완충액을 섹션에 추가합니다. 말초 혈액 단핵 세포는 식세포 집단을 정의하기 위해 전방 및 측면 산란을 사용하여 게이트되었습니다. 식세포 집단은 단핵구를 표지하기 위해 CD14 발현에 의해 추가로 정의되었다.ROS 측정은 형광을 생성하기 위해 DHR 123의 산화를 통해 수행되었습니다. 자극된 샘플의 중앙값 형광을 대조군과 비교하였다. 림프구에 의한 세포내 사이토카인 생산은 유세포분석을 사용하여 측정하였다.세포를 먼저 백혈구 마커 CD45의 발현에 대해 분석한 다음 CD 3 및 CD 4, CD 8에 대해 분석했습니다. CD3, CD4 양성 세포를 대조군 및 자극된 샘플에서 세포내 시토카인 생산에 대해 평가하였다. 프로테아제 활성은 고정되지 않은 폐 조직 절편에서 NC 2개의 접합조영술로 측정하였다.형광 염색은 MMP 활성의 존재를 나타내었고, 이는 또한 염색질의 발현과 함께 국소화되었다. 폐 조직 샘플에 항체를 추가하려면 농축이 필요하며 세포의 염색은 예비 실험에서 최적화가 필요합니다. 폐 조직 샘플의 상청액은 ELISA와 같은 기술을 사용하여 다른 염증 매개체에 대해 추가로 분석될 수 있으며, 이들 기술은 폐 염증에 대한 잠재적 치료법의 효과를 평가하기 위해 사용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

효소 링크된 Immunospot 분석 (ELISPOT) : 미생물 항원 반대 예뻐 - 1 세포 면역 반응의 부량

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

양극화 인간기도 액체 덮인 문화를 구축 호흡기 병원균에 대한 숙주 세포 응답을 공부하는 상피 Calu-3 전지<em&gt; 체외에서</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...