Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Forfatterne vil takke personalet for klinisk immunologi ved Monash Health for deres hjelp med dette arbeidet.

Dette arbeidet ble godkjent av den humane forskningsetiske komiteen i Monash Health. Protokollen følger retningslinjene til den forskningsetiske komiteen.
1. Antigen preparat
MERK: Tre forskjellige antigene preparater kan brukes til å vurdere immunresponsen mot Hi. Disse er 1) en subcellulær komponent (vanligvis fra bakteriecelleveggen); 2) drepte og inaktiverte bakterier; og 3) levende bakterier. Bestem bruken av hvert antigenpreparat før oppstart av eksperimente...

<ol>
	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

Metodene som er oppført her bruker fluorescensbasert flowcytometri og konfokale mikroskopiteknikker som kan brukes sammen for å få detaljert informasjon om den inflammatoriske lungeresponsen på Hi.
Etablering av riktig antigenformulering av Hi som skal brukes er kritisk, og det anbefales å ha spesifikke innspill fra en mikrobiolog i denne forbindelse. Live Hi induserer en sterkere respons, mens drepte Hei-preparater og Heis-komponenter er mer standardiserte og er enklere å lagre. PI vil ...

Haemophilus influenzae (Hi) er en normal kommensale bakterie som finnes i svelget hos de fleste friske voksne. Hei kan ha en polysakkaridkapsel (type A-F, f.eks. type B eller HiB) eller mangle en kapsel og være ikke-typebar (NTHi)1. Kolonisering av slimhinnen med denne bakterien begynner i tidlig barndom, og det er en omsetning av forskjellige koloniserendestammer. Denne bakterien er også i stand til invasjon av både øvre og nedre luftveier; I denne sammenheng kan det indusere aktivering av immunresponsen og betennelse 3,4. Denne inflammatoriske responsen kan forårsake klinisk sykdom og bidra til en rekke viktige respiratoriske tilstander, inkludert bihulebetennelse, otitis media, bronkitt, cystisk fibrose, lungebetennelse og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOL). De fleste av disse forholdene skyldes NTHi-stammer2. Denne artikkelen vil beskrive metoder for å vurdere respiratoriske immunresponser mot Hi ved hjelp av flowcytometri og konfokalmikroskopi.
Metodene beskrevet nedenfor er tilpasset fra veletablerte teknikker som er modifisert for å vurdere inflammatorisk respons på Hi. Valget av en passende antigen form for Hi er en sentral del av denne vurderingen. Antigene preparater spenner fra celleveggkomponenter til levende bakterier. For å etablere og standardisere analyser, kan bruk av perifere blodprøver være svært nyttig i utgangspunktet.
Flowcytometri gjør det mulig å måle en rekke parametere og funksjonsanalyser fra en prøve på cellenivå. Denne teknikken har den fordelen at spesifikke cellulære responser (f.eks. produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) eller intracellulær cytokinproduksjon) kan vurderes sammenlignet med andre mer generelle metoder som enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) eller ELISspot.
Ekstracellulære feller uttrykkes av nøytrofiler (NETs)5,6,7 og av andre celler som makrofager (METs)8. De blir i økende grad anerkjent som en viktig inflammatorisk respons, spesielt ved infeksjon i lungen9. De kan vurderes ved konfokal fluorescensmikroskopi. Denne teknikken tillater definitiv identifisering av NETS / MET og skiller deres uttrykk fra andre former for celledød6.
Både flowcytometri og konfokalmikroskopi er fluorescensbaserte analyser. Deres suksess er avhengig av optimale belastningsprotokoller for biologiske prøver. Disse metodene tar litt tid å lære og krever passende tilsynskompetanse. Instrumentene som er involvert er også dyre både å kjøpe og drive. Den optimale innstillingen for deres bruk inkluderer store universiteter og tertiære henvisningssykehus.
Metodene som brukes i denne protokollen er overførbare for studier av andre lignende organismer involvert i luftveissykdom (f.eks. Moxarella catarrhalis og Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerer også med andre vanlige respiratoriske bakterier10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) er en utbredt bakterie som finnes ved en rekke luftveislidelser. En rekke forskjellige analyser / teknikker kan brukes til å vurdere respiratorisk immun / inflammatorisk respons på denne bakterien. Flowcytometri og konfokalmikroskopi er fluorescensbaserte teknologier som tillater detaljert karakterisering av biologiske responser. Ulike former for Hi-antigen kan brukes, inkludert celleveggkomponenter, drepte / inaktiverte preparater og levende bakterier. Hei er en kresen bakterie som krever berikede medier, men er generelt lett å dyrke i standard laboratorieinnstillinger. Vevsprøver for stimulering med Hi kan fås fra perifert blod, bronkoskopi eller resektert lunge (f.eks. hos pasienter som gjennomgår kirurgi for behandling av lungekreft). Makrofag og nøytrofil funksjon kan vurderes grundig ved hjelp av flowcytometri med en rekke parametere målt, inkludert fagocytose, reaktive oksygenarter og intracellulær cytokinproduksjon. Lymfocyttfunksjonen (f.eks. T-celle- og NK-cellefunksjon) kan vurderes spesifikt ved hjelp av flowcytometri, hovedsakelig for intracellulær cytokinproduksjon. Hei-infeksjon er en potent induktor av ekstracellulær felleproduksjon, både av nøytrofiler (NETs) og makrofager (METs). Konfokalmikroskopi er uten tvil den mest optimale måten å vurdere NET- og MET-uttrykk, som også kan brukes til å vurdere proteaseaktivitet. Lungeimmunitet mot Haemophilus influenzae kan vurderes ved hjelp av flowcytometri og konfokalmikroskopi.

De representative resultatene viser hvordan inflammatorisk immunrespons mot NTHi kan vurderes/kvantifiseres ved flowcytometri og konfokalmikroskopi. En sentral del av tolkningen av resultatene er sammenligningen i fluorescens mellom kontroll og stimulerte prøver. En rekke foreløpige eksperimenter er vanligvis nødvendig for å optimalisere fargingen av prøver. Hvor mange forskjellige farger som kan undersøkes samtidig vil avhenge av antall kanaler som er tilgjengelige på flowcytometeret/konfokalmikroskopet. Resultat...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induserer betennelse i luftveiene. Denne artikkelen vil fokusere på bruk av flowcytometri og konfokalmikroskopi for å definere immunresponser av fagocytter og lymfocytter som respons på denne bakterien.

Vurdering av respiratorisk immunrespons på Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influensa er en viktig årsak til betennelse i ulike kroniske lungesykdommer, inkludert KOLS og lungebetennelse. Denne protokollen beskriver metoder for å vurdere effekten av haemophilus på lungebetennelse. Fordelene med denne teknikken er at den muliggjør en omfattende vurdering av medfødte og adaptive immunresponser.Inkuber 450 mikroliter perifert blod med 50 mikroliter av et aktivert propidiumjodid merket H influenzae i et fem milliliter rør i 20 minutter i et vannbad ved 37 grader Celsius. Fjern prøven fra vannbadet, tilsett fem mikroliter DHR og virvel i 10 sekunder. Legg den deretter tilbake i vannbadet i ytterligere 10 minutter.Etter å ha fjernet prøven fra vannbadet, lyse erytrocytene med fem milliliter 0,8% ammoniumkloridoppløsning og analysere prøvene på et flowcytometer som beskrevet i teksten. Del den perifere blodprøven i aliquots for kontroll og antigenstimulering. Legg til costimulatoriske antistoffer til begge prøvene.Tilsett deretter den ikke-typbare H influenzae til antigenprøven og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i en time. Deretter legger du Golgi-blokkeringsmiddelet brefeldin A til prøvene og inkuberer dem i ytterligere fem timer. Etter lysing av erytrocytter som vist tidligere, fiks leukocyttene ved hjelp av 500 mikroliter av en til 2% para-formaldehyd i en time.Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer, og permeabiliser deretter 1 million celler med 100 mikroliter 0,1% saponin i 15 minutter. Deretter inkuberer cellene med passende fluorescerende merkede antistoffer. Vask cellene, og analyser dem deretter ved hjelp av et flowcytometer.Bestem andelen antigenresponderende celler ved å få de relevante lymfocyttpopulasjonene. Utfør bakgrunnsfarging på ikke-stimulerte celler for alle cytokinene som skal analyseres. Del omtrent 20 til 40 gram av lobektomiprøven i tre til fem kubikkmillimeter seksjoner.Plasser dem inne i et sterilt 50 mikroliter kammer og fragmenter vevet mekanisk ved hjelp av en passende disaggregator. Etter vevsdisaggregering, lyse de røde blodcellene som demonstrert og resuspendere cellene i steril RPMI. Filtrer deretter cellene gjennom et 100 mikrometer sterilt nylonnett og tell av levedyktige celler ved hjelp av trypan blå eksklusjonsmetode.For infeksjonsanalysen, resuspend lungecellene i RPMI til en endelig konsentrasjon på 4 millioner celler per milliliter per rør. Deretter infiserer cellene ved en MOI på 100 bakterier per celle. Løsne hetten en halv rotasjon for å tillate gassoverføring i rørene.Plasser cellene i rørrotatoren og inkuber dem ved 37 grader Celsius mens du roterer ved 12 o / min. En time etter stimulering, tilsett grefeldin A for å forhindre ekstracellulær eksport av cytokiner og inkuber cellesuspensjonene i ytterligere 16 til 22 timer med rotasjon. Påfølgende dag vaskes cellesuspensjonen med 500 mikroliter PBS som inneholder 1 % bovint serumalbumin og 0,01 % natriumazid.Deretter flekker cellesuspensjonen for spesifikke humane lymfocytter celleoverflatemarkører i en time. Vask deretter cellene med PBS og fikse og permeabilisere dem som vist tidligere. Deretter inkuberer cellene med intracellulære cytokinfargingsantistoffer i en time.Vask deretter cellene og resuspend dem i 100 mikroliter PBS før datainnsamling på et flowcytometer. Mål proteolyse via virkningen av metalloproteinaser, tilsett fluoresceinmerket gelatinsubstrat direkte på lungevevsseksjonsglassene. Plasser lysbildene horisontalt og inkuber dem i et lysbeskyttet fuktet kammer ved 37 grader Celsius i en time.For å forberede negative kontroller, legg til en x reaksjonsbuffer uten fluorescerende gelatin til seksjonene for videre analyse. Perifere mononukleære blodceller ble inngjerdet ved hjelp av fremover og side spredt for å definere fagocytpopulasjonen. Fagocyttpopulasjonen ble videre definert ved CD14-ekspresjon for å merke monocyttene.ROS-måling ble utført via oksidasjon av DHR 123 for å produsere fluorescens. Median fluorescens av den stimulerte prøven ble sammenlignet med kontrollen. Intracellulær cytokinproduksjon av lymfocytter ble målt med flowcytometri.Celler ble analysert først for deres uttrykk av leukocyttmarkøren CD45 og deretter for CD tre og CD fire, CD åtte. CD tre, CD fire positive celler ble vurdert for intracellulær cytokinproduksjon i kontroll- og stimulerte prøver. Proteaseaktiviteten ble målt ved NC to zymografi i ufikserte lungevevspartier.Fluorescerende farging indikerte tilstedeværelsen av MMP-aktivitet, som også ble samlokalisert med uttrykket av kromatin. Tilsetning av antistoffer til lungevevsprøvene krever konsentrasjon og farging av cellene vil kreve optimalisering i foreløpige eksperimenter. Supernatanten av lungevevsprøvene kan analyseres videre for andre inflammatoriske mediatorer ved hjelp av teknikker som ELISA, og disse teknikkene kan brukes til å vurdere effekten av potensielle terapier på lungebetennelse.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell for måling av immunresponser mot Malaria i sammenheng med HIV Samtidig infeksjon

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administrasjon av<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musemodeller for å studere Airway betennelse

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Ved hjelp av sebrafisk modeller av menneskelig influensa A virus infeksjoner til skjerm antivirale medikamenter og karakter vertens immuncellere

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...