Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников клинической иммунологии Monash Health за помощь в этой работе.

Эта работа была одобрена комитетом по этике исследований человека Monash Health. Протокол следует руководящим принципам комитета по этике исследований человека.
1. Антигенный препарат
ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных антигенных препарата могут быть использованы для о?...

<ol>
	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

Методы, перечисленные здесь, используют флуоресцентную проточную цитометрию и методы конфокальной микроскопии, которые могут быть использованы в сочетании для получения подробной информации о воспалительной реакции легких на Hi.
Установление соответствующей антигенн?...

Haemophilus influenzae (Hi) является нормальной комменсальной бактерией, присутствующей в глотке большинства здоровых взрослых. Hi может иметь полисахаридную капсулу (типы A-F, например, тип B или HiB) или не иметь капсулы и быть нетипируемым (NTHi)1. Колонизация слизистой этой бактерией начинается в раннем детстве, и происходит оборот различных колонизирующих штаммов2. Эта бактерия также способна к инвазии как в верхние, так и в нижние дыхательные пути; в этом контексте он может вызвать активацию иммунного ответа и воспаление 3,4. Эта воспалительная реакция может вызвать клиническое заболевание и способствовать различным важным респираторным заболеваниям, включая синусит, средний отит, бронхит, муковисцидоз, пневмонию и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Большинство из этих состояний обусловлены штаммами NTHi2. В этой статье будут описаны методы оценки респираторных иммунных реакций на Hi с использованием проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.
Методы, описанные ниже, были адаптированы из хорошо зарекомендовавших себя методов, которые были модифицированы для оценки воспалительной реакции на Hi. Выбор подходящей антигенной формы Hi является ключевой частью этой оценки. Антигенные препараты варьируются от компонентов клеточной стенки до живых бактерий. Для установления и стандартизации анализов использование образцов периферической крови может быть очень полезным на начальном этапе.
Проточная цитометрия позволяет измерять различные параметры и функциональные анализы из одного образца на клеточном уровне. Этот метод имеет то преимущество, что специфические клеточные реакции (например, производство активных форм кислорода (АФК) или внутриклеточная продукция цитокинов) могут быть оценены по сравнению с другими более общими методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) или ELISspot.
Внеклеточные ловушки экспрессируются нейтрофилами (NETs)5,6,7 и другими клетками, такими как макрофаги (METs)8. Они все чаще признаются в качестве ключевой воспалительной реакции, особенно при инфекции в легких9. Они могут быть оценены с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Этот метод позволяет окончательно идентифицировать НЭТ/МЕТ и отличает их экспрессию от других форм гибели клеток6.
Как проточная цитометрия, так и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными анализами. Их успех зависит от оптимальных протоколов процеживания биологических образцов. Эти методы занимают некоторое время для изучения и требуют соответствующего надзорного опыта. Задействованные инструменты также дороги как для покупки, так и для запуска. Оптимальная среда для их использования включает в себя крупные университеты и третичные специализированные больницы.
Методы, используемые в этом протоколе, переносятся для изучения других подобных организмов, участвующих в респираторных заболеваниях (например, Moxarella catarrhalis и Streptococcus pneumoniae). NTHi также взаимодействует с другими распространенными респираторными бактериями10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) является распространенной бактерией, обнаруженной в ряде респираторных заболеваний. Различные анализы / методы могут быть использованы для оценки респираторного иммунного / воспалительного ответа на эту бактерию. Проточная цитометрия и конфокальная микроскопия являются флуоресцентными технологиями, которые позволяют детально характеризовать биологические реакции. Могут быть использованы различные формы антигена Hi, включая компоненты клеточной стенки, убитые / инактивированные препараты и живые бактерии. Hi - это привередливая бактерия, которая требует обогащенных сред, но, как правило, легко выращивается в стандартных лабораторных условиях. Образцы тканей для стимуляции Hi могут быть получены из периферической крови, бронхоскопии или резецированного легкого (например, у пациентов, перенесших операцию по лечению рака легких). Функция макрофагов и нейтрофилов может быть всесторонне оценена с использованием проточной цитометрии с различными измеренными параметрами, включая фагоцитоз, активные формы кислорода и внутриклеточную продукцию цитокинов. Функция лимфоцитов (например, функция Т-клеток и NK-клеток) может быть специально оценена с помощью проточной цитометрии, главным образом для внутриклеточной продукции цитокинов. Hi-инфекция является мощным индуктором внеклеточной ловушки, как нейтрофилами (NETs), так и макрофагами (METs). Конфокальная микроскопия, возможно, является наиболее оптимальным способом оценки экспрессии NET и MET, который также может быть использован для оценки активности протеазы. Иммунитет легких к Haemophilus influenzae можно оценить с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии.

Репрезентативные результаты показывают, как воспалительные иммунные реакции на NTHi могут быть оценены / количественно оценены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Ключевой частью интерпретации результатов является сравнение флуоресценции между контрольными и ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae вызывает воспаление в дыхательных путях. Эта статья будет посвящена использованию проточной цитометрии и конфокальной микроскопии для определения иммунных реакций фагоцитов и лимфоцитов в ответ на эту бактерию.

Оценка респираторных иммунных реакций на Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Гемофильный грипп является основной причиной воспаления при различных хронических заболеваниях легких, включая ХОБЛ и пневмонию. Этот протокол описывает методы оценки влияния гемофилуса на воспаление легких. Преимущества этой методики заключаются в том, что она позволяет проводить комплексную оценку врожденных и адаптивных иммунных реакций.Инкубировать 450 микролитров периферической крови с 50 микролитрами активированного йодида пропидия, меченного H influenzae, в пятимиллилитровой трубке в течение 20 минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия. Извлеките образец из водяной бани, добавьте пять микролитров DHR и вихрь в течение 10 секунд. Затем поместите его обратно на водяную баню еще на 10 минут.После извлечения образца с водяной бани лизируют эритроциты пятью миллилитрами 0,8% раствора хлорида аммония и анализируют образцы на проточном цитометре, как описано в тексте. Разделите образец периферической крови на аликвоты для контроля и стимуляции антигена. Добавьте костимуляторные антитела к обоим образцам.Затем добавьте нетипичную H influenzae в образец антигена и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа. Затем добавьте блокирующий агент Гольджи брефельдин А к образцам и инкубируйте их еще в течение пяти часов. После лизирования эритроцитов, как показано ранее, зафиксируйте лейкоциты с помощью 500 микролитров от одного до 2% параформальдегида в течение одного часа.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем пронизывайте 1 миллион клеток 100 микролитрами 0,1% сапонина в течение 15 минут. Затем инкубируйте клетки с соответствующими флуоресцентно мечеными антителами. Промыть клетки, затем проанализировать их с помощью проточного цитометра.Определите долю клеток, реагирующих на антиген, получив соответствующие популяции лимфоцитов. Выполните фоновое окрашивание на нестимулированных клетках для всех анализируемых цитокинов. Нарежьте от 20 до 40 граммов образца лобэктомии на три-пять кубических миллиметровых секций.Поместите их внутрь стерильной 50-микролитровой камеры и механически фрагментируйте ткань с помощью соответствующего дезагрегатора. После дезагрегации тканей лизируют эритроциты, как показано, и повторно суспендируют клетки в стерильном RPMI. Затем отфильтруйте клетки через 100-микрометровую стерильную нейлоновую сетку и подсчитайте жизнеспособные клетки, используя метод исключения синего трипана.Для анализа инфекции повторно суспендируйте клетки легких в RPMI до конечной концентрации 4 миллиона клеток на миллилитр на трубку. Затем заражайте клетки при MOI 100 бактерий на клетку. Ослабьте колпачок на половину оборота, чтобы обеспечить передачу газа в трубках.Поместите клетки в ротатор трубки и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия, вращаясь при 12 оборотах в минуту. Через час после стимуляции добавляют грефельдин А для предотвращения внеклеточного экспорта цитокинов и инкубируют клеточные суспензии в течение еще 16-22 часов с ротацией. На следующий день промыть клеточную суспензию 500 микролитрами PBS, содержащими 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% азида натрия.Далее окрашивают клеточную суспензию для специфических маркеров клеточной поверхности лимфоцитов человека в течение одного часа. Затем промыть клетки PBS и зафиксировать и пропитать их, как показано ранее. Затем инкубируют клетки с внутриклеточными антителами окрашивания цитокинов в течение одного часа.Затем промыть клетки и повторно суспендировать их в 100 микролитрах PBS перед сбором данных на проточном цитометре. Измерьте протеолиз с помощью действия металлопротеиназ, добавьте флуоресцеиновую меченую желатиновую подложку непосредственно на слайды среза легочной ткани. Поместите горки горизонтально и высиживайте их в защищенной светом увлажненной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.Чтобы подготовить отрицательные контрольные элементы, добавьте один буфер х реакции без флуоресцентного желатина в секции для дальнейшего анализа. Мононуклеарные клетки периферической крови были закрыты с использованием переднего и бокового рассеяния для определения популяции фагоцитов. Популяция фагоцитов была дополнительно определена экспрессией CD14 для маркировки моноцитов.Измерение АФК проводили путем окисления DHR 123 с получением флуоресценции. Среднюю флуоресценцию стимулированного образца сравнивали с контрольной. Внутриклеточную выработку цитокинов лимфоцитами измеряли с помощью проточной цитометрии.Клетки были проанализированы сначала на экспрессию маркера лейкоцитов CD45, а затем на CD три и CD четыре, CD восемь. CD три, CD четыре положительные клетки были оценены на внутриклеточную продукцию цитокинов в контрольных и стимулированных образцах. Активность протеазы измеряли с помощью nc two zymography в нефиксированных участках легочной ткани.Флуоресцентное окрашивание указывало на наличие активности MMP, которая также была солидаризирована с экспрессией хроматина. Добавление антител в образцы легочной ткани требует концентрации, а окрашивание клеток потребует оптимизации в предварительных экспериментах. Супернатант образцов легочной ткани может быть дополнительно проанализирован на предмет других медиаторов воспаления с использованием таких методов, как ИФА, и эти методы могут быть использованы для оценки влияния потенциальных методов лечения на воспаление легких.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Фермент связанных Immunospot анализ (ELISPOT): Количественная оценка Th-1 клеточного иммунного ответа против микробных антигенов

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Seven Steps to Stellate Cells

Семь шагов к звездчатых клеток

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Измерение бактериальной нагрузки и иммунного ответа в мышей, инфицированных Listeria моноцитогенес</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Количественная оценка респираторный взрыв ответ как показатель врожденной иммунной здравоохранения в данио рерио

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель для измерения иммунных ответов на малярией в контексте ВИЧ-инфекцией

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-трахеи Администрация<em&gt; Гемофильной</em&gt; В мышиные модели для изучения Воспаление дыхательных путей

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Использование данио рерио модели человеческого вируса гриппа А инфекций экрана противовирусных препаратов и характеризации иммунных клеток-хозяев ответов

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...