Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
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Los autores desean agradecer al personal de Inmunología Clínica de Monash Health por su ayuda con este trabajo.

Este trabajo fue aprobado por el comité de ética de investigación humana de Monash Health. El protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación humana.
1. Preparación antigénica
NOTA: Se pueden usar tres preparaciones antigénicas diferentes para evaluar la respuesta inmune al Hi. Estos son 1) un componente subcelular (típicamente de la pared celular bacteriana); 2) bacterias muertas e inactivadas; y 3) bacterias vivas. Determinar el uso de...

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	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

Los métodos enumerados aquí utilizan citometría de flujo basada en fluorescencia y técnicas de microscopía confocal que se pueden utilizar en conjunto para obtener información detallada sobre la respuesta pulmonar inflamatoria a Hi.
Establecer la formulación antigénica apropiada de Hi para ser utilizada es fundamental, y es aconsejable contar con aportes específicos de un microbiólogo a este respecto. Live Hi induce una respuesta más fuerte, mientras que las preparaciones de Hi muer...

Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria comensal normal presente en la faringe de la mayoría de los adultos sanos. Hi puede tener una cápsula de polisacárido (tipos A-F, por ejemplo, tipo B o HiB) o carecer de una cápsula y no ser tipificable (NTHi)1. La colonización de la mucosa con esta bacteria comienza en la primera infancia, y hay un recambio de diferentes cepas colonizadoras2. Esta bacteria también es capaz de invadir tanto el tracto respiratorio superior como el inferior; En este contexto, puede inducir la activación de la respuesta inmune y la inflamación 3,4. Esta respuesta inflamatoria puede causar enfermedad clínica y contribuir a una variedad de afecciones respiratorias importantes, como sinusitis, otitis media, bronquitis, fibrosis quística, neumonía y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La mayoría de estas condiciones se deben a las cepasNTHi 2. Este artículo describirá métodos para evaluar las respuestas inmunes respiratorias a Hi utilizando citometría de flujo y microscopía confocal.
Los métodos descritos a continuación se han adaptado a partir de técnicas bien establecidas que se han modificado para evaluar la respuesta inflamatoria a Hi. La selección de una forma antigénica apropiada de Hi es una parte clave de esta evaluación. Las preparaciones antigénicas van desde componentes de la pared celular hasta bacterias vivas. Para establecer y estandarizar los ensayos, el uso de muestras de sangre periférica puede ser muy útil inicialmente.
La citometría de flujo permite la medición de una variedad de parámetros y ensayos funcionales de una muestra a nivel celular. Esta técnica tiene la ventaja de que las respuestas celulares específicas (por ejemplo, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o la producción de citoquinas intracelulares) se pueden evaluar en comparación con otros métodos más generales, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o ELISspot.
Las trampas extracelulares son expresadas por neutrófilos (TNE)5,6,7 y por otras células como los macrófagos (MET)8. Son cada vez más reconocidos como una respuesta inflamatoria clave, particularmente en la infección en el pulmón9. Pueden evaluarse mediante microscopía de fluorescencia confocal. Esta técnica permite la identificación definitiva de los TNE/MET y distingue su expresión de otras formas de muerte celular6.
Tanto la citometría de flujo como la microscopía confocal son ensayos basados en fluorescencia. Su éxito depende de protocolos de filtrado óptimos de muestras biológicas. Estos métodos toman algún tiempo para aprender y requieren la experiencia de supervisión adecuada. Los instrumentos involucrados también son caros tanto de comprar como de ejecutar. El entorno óptimo para su uso incluye las principales universidades y hospitales terciarios de referencia.
Los métodos utilizados en este protocolo son transferibles para el estudio de otros organismos similares implicados en enfermedades respiratorias (por ejemplo, Moxarella catarrhalis y Streptococcus pneumoniae). NTHi también interactúa con otras bacterias respiratorias comunes10.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria prevalente que se encuentra en una variedad de afecciones respiratorias. Se puede usar una variedad de diferentes ensayos / técnicas para evaluar la respuesta inmune / inflamatoria respiratoria a esta bacteria. La citometría de flujo y la microscopía confocal son tecnologías basadas en fluorescencia que permiten la caracterización detallada de las respuestas biológicas. Se pueden usar diferentes formas de antígeno Hi, incluidos componentes de la pared celular, preparaciones muertas / inactivadas y bacterias vivas. Hi es una bacteria fastidiosa que requiere medios enriquecidos, pero generalmente es fácil de cultivar en entornos de laboratorio estándar. Las muestras de tejido para la estimulación con Hi se pueden obtener de sangre periférica, broncoscopia o pulmón resecado (p. ej., en pacientes sometidos a cirugía para el tratamiento del cáncer de pulmón). La función de los macrófagos y los neutrófilos se puede evaluar exhaustivamente mediante citometría de flujo con una variedad de parámetros medidos, incluida la fagocitosis, las especies reactivas de oxígeno y la producción de citoquinas intracelulares. La función de los linfocitos (p. ej., la función de las células T y NK) puede evaluarse específicamente mediante citometría de flujo, principalmente para la producción de citoquinas intracelulares. La infección por Hi es un potente inductor de la producción de trampas extracelulares, tanto por neutrófilos (NET) como por macrófagos (MET). La microscopía confocal es posiblemente la forma más óptima de evaluar la expresión de NET y MET, que también se puede utilizar para evaluar la actividad de la proteasa. La inmunidad pulmonar a Haemophilus influenzae puede evaluarse mediante citometría de flujo y microscopía confocal.

Los resultados representativos muestran cómo las respuestas inmunes inflamatorias a NTHi pueden ser evaluadas / cuantificadas por citometría de flujo y microscopía confocal. Una parte clave de la interpretación de los resultados es la comparación en fluorescencia entre muestras de control y estimuladas. Por lo general, se requieren una serie de experimentos preliminares para optimizar la tinción de las muestras. Cuántos colores diferentes se pueden examinar simultáneamente dependerá del número de canales dispon...

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Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae induce inflamación en el tracto respiratorio. Este artículo se centrará en el uso de la citometría de flujo y la microscopía confocal para definir las respuestas inmunes de fagocitos y linfocitos en respuesta a esta bacteria.

Evaluación de las respuestas inmunitarias respiratorias a Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influenza es una causa importante de inflamación en diversas enfermedades pulmonares crónicas, como la EPOC y la neumonía. Este protocolo describe métodos para evaluar el efecto de haemophilus sobre la inflamación pulmonar. Las ventajas de esta técnica es que permite una evaluación exhaustiva de las respuestas inmunes innatas y adaptativas.Incubar 450 microlitros de sangre periférica con 50 microlitros de un yoduro de propidio activado marcado con H influenzae en un tubo de cinco mililitros durante 20 minutos en un baño maría a 37 grados centígrados. Retire la muestra del baño maría, agregue cinco microlitros de DHR y vórtice durante 10 segundos. Luego colóquelo de nuevo en el baño de agua durante otros 10 minutos.Después de retirar la muestra del baño de agua, lisar los eritrocitos con cinco mililitros de solución de cloruro de amonio al 0,8% y analizar las muestras en un citómetro de flujo como se describe en el texto. Dividir la muestra de sangre periférica en alícuotas para el control y la estimulación del antígeno. Agregue anticuerpos coestimuladores a ambas muestras.Luego agregue el H influenzae no tipificable a la muestra de antígeno e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, agregue el agente bloqueador de Golgi brefeldin A a las muestras e incubarlas durante otras cinco horas. Después de lisar los eritrocitos como se demostró anteriormente, fijar los leucocitos utilizando 500 microlitros de uno a 2% de para-formaldehído durante una hora.Cuente las células con un hemocitómetro, luego permeabilice 1 millón de células con 100 microlitros de saponina al 0,1% durante 15 minutos. A continuación, incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescencia apropiados. Lave las células, luego analícelas con un citómetro de flujo.Determinar la proporción de células que responden al antígeno obteniendo las poblaciones de linfocitos relevantes. Realizar tinción de fondo en células no estimuladas para todas las citoquinas a analizar. Corte alrededor de 20 a 40 gramos de la muestra de lobectomía en tres a cinco secciones milimétricas cúbicas.Colóquelos dentro de una cámara estéril de 50 microlitros y fragmente mecánicamente el tejido utilizando un desagregador apropiado. Después de la desagregación tisular, lisar los glóbulos rojos como se demostró y resuspender las células en RPMI estéril. Luego filtre las células a través de una malla de nylon estéril de 100 micrómetros y cuente las células viables utilizando el método de exclusión de azul de tripano.Para el ensayo de infección, resuspender las células pulmonares en RPMI a una concentración final de 4 millones de células por mililitro por tubo. Luego infectar las células a un MOI de 100 bacterias por célula. Afloje la tapa media rotación para permitir la transferencia de gas en los tubos.Coloque las células en el rotador del tubo e incubarlas a 37 grados centígrados mientras gira a 12 RPM. Una hora después de la estimulación, agregue grefeldina A para evitar la exportación extracelular de citoquinas e incube las suspensiones celulares durante otras 16 a 22 horas con rotación. Al día siguiente, lave la suspensión celular con 500 microlitros de PBS que contengan 1% de albúmina sérica bovina y 0,01% de azida de sodio.A continuación, tiñe la suspensión celular para marcadores específicos de superficie celular de linfocitos humanos durante una hora. Luego lave las células con PBS y fíjelas y permeabilícelas como se demostró anteriormente. A continuación, incubar las células con anticuerpos de tinción de citoquinas intracelulares durante una hora.Luego lave las células y resuspenda en 100 microlitros de PBS antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo. Mida la proteólisis a través de la acción de las metaloproteinasas, agregue sustrato de gelatina marcado con fluoresceína directamente en los portaobjetos de la sección de tejido pulmonar. Coloque los portaobjetos horizontalmente e incubarlos en una cámara humidificada protegida por la luz a 37 grados centígrados durante una hora.Para preparar controles negativos, agregue un tampón de reacción x sin gelatina fluorescente a las secciones para su posterior análisis. Las células mononucleares de sangre periférica se cerraron utilizando dispersión hacia adelante y hacia los lados para definir la población de fagocitos. La población de fagocitos se definió aún más por la expresión de CD14 para marcar los monocitos.La medición de ROS se realizó mediante oxidación de DHR 123 para producir fluorescencia. La mediana de fluorescencia de la muestra estimulada se comparó con el control. La producción de citoquinas intracelulares por los linfocitos se midió mediante citometría de flujo.Las células se analizaron primero por su expresión del marcador leucocitario CD45 y luego para el CD tres y el CD cuatro, CD ocho. Las células positivas CD tres, CD cuatro se evaluaron para la producción intracelular de citoquinas en muestras de control y estimuladas. La actividad de la proteasa se midió mediante dos zimografías NC en secciones de tejido pulmonar no fijadas.La tinción fluorescente indicó la presencia de actividad MMP, que también se colocalizó con la expresión de cromatina. La adición de anticuerpos a las muestras de tejido pulmonar requiere concentración y la tinción de las células requerirá optimización en experimentos preliminares. El sobrenadante de las muestras de tejido pulmonar se puede analizar más a fondo para otros mediadores inflamatorios utilizando técnicas como ELISA y Estas técnicas se pueden utilizar para evaluar el efecto de las terapias potenciales sobre la inflamación pulmonar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzima-inmunoensayo de ensayo (ELISPOT): La cuantificación de la Th-1 respuesta inmune celular contra antígenos microbianos

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Seven Steps to Stellate Cells

Siete pasos para células estrelladas

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medir la respuesta inmune a la malaria en el contexto del VIH Co-infección

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...