Name: assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae
Uploaded: 2021-06-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Författarna vill tacka personalen på Clinical Immunology på Monash Health för deras hjälp med detta arbete.

Detta arbete godkändes av den mänskliga forskningsetiska kommittén för Monash Health. Protokollet följer riktlinjerna från den etikprövningsetiska kommittén för mänsklig forskning.
1. Antigenpreparat
OBS: Tre olika antigena preparat kan användas för att bedöma immunsvaret mot Hi. Dessa är 1) en subcellulär komponent (vanligtvis från bakteriecellväggen); 2) dödade och inaktiverade bakterier; och 3) levande bakterier. Bestäm användningen av varje ant...

<ol>
	<li>Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+genetic+diversity+of+Haemophilus+influenzae+type+b+compared+to+nonencapsulated+H.+influenzae+in+a+population+in+which+H.+influenzae+is+highly+endemic.">Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic.</a> Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).</li><li>Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemophilus+and+Moxarella+infections.">Haemophilus and Moxarella infections.</a> Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).</li><li>King, P. T., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lung+immune+response+to+nontypeable+haemophilus+influenzae+(lung+immunity+to+NTHi).">The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi).</a> Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).</li><li>Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+persistent+airway+infection+by+non-typeable+Haemophilus+influenzae+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).</li><li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease.">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).</li><li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+traps+and+macrophages:+new+roles+for+the+versatile+phagocyte.">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).</li><li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+balancing:+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases.">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).</li><li>Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lower+airway+bacterial+colonization+patterns+and+species-specific+interactions+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).</li><li>Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtyping+isolates+of+Haemophilus+influenzae+type+b+by+outer-membrane+protein+profiles.">Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles.</a> The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).</li><li>Barenkamp, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+proteins+and+lipopolysaccharides+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae.</a> The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).</li><li>Johnston, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+growth+and+maintenance+of+Haemophilus+influenzae.">Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2010).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immunity+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae.">Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).</li><li>Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+media+for+growth+of+Haemophilus+influenzae+strains.">Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains.</a> Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).</li><li>King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+humoral+immunity+to+non-typeable+Haemophilus+influenzae.">Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression.">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PLoS One. 10, 0120371 (2015).</li><li>Aaron, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte+inflammatory+markers+and+airway+infection+during+acute+exacerbation+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).</li><li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+T-cell+responses+to+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).</li><li>Tsujikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cell+detection+and+segmentation+for+image+cytometry+reveal+th17+cell+heterogeneity.">Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity.</a> Cytometry A. 95, 389-398 (2019).</li><li>Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+macrophage+extracellular+traps+using+confocal+microscopy.">Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. 15, 36 (2015).</li><li>Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+Lactobacillus+plantarum+to+monitor+lag+times,+cell+division+and+injury.">Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury.</a> Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).</li><li>Essilfie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Haemophilus+influenzae+respiratory+infection+and+allergic+airways+disease+drives+chronic+infection+and+features+of+neutrophilic+asthma.">Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma.</a> Thorax. 67, 588-599 (2012).</li><li>Huvenne, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exacerbation+of+cigarette+smoke-induced+pulmonary+inflammation+by+Staphylococcus+aureus+enterotoxin+B+in+mice.">Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice.</a> Respiratory Research. 12, 69 (2011).</li><li>Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Techniques+for+Optimal+Performance+of+Bronchoalveolar+Lavage.">A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage.</a> Journal of Bronchology &amp; Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).</li><li>Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+disaggregation+method+for+human+lung+tumors+that+preserves+the+phenotype+and+function+of+the+immune+cells.">An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).</li><li>Tighe, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+quality+and+reproducibility+of+flow+cytometry+in+the+lung.+An+official+American+thoracic+society+workshop+report.">Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11, 0150606 (2016).</li><li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+subpopulations+characterize+acute+infection+and+chronic+inflammatory+lung+disease.">Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease.</a> Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).</li></ol>

Metoderna som listas här använder fluorescensbaserad flödescytometri och konfokalmikroskopitekniker som kan användas tillsammans för att få detaljerad information om det inflammatoriska lungsvaret på Hi.
Att fastställa lämplig antigenformulering av Hi som ska användas är avgörande, och det är lämpligt att ha specifik input från en mikrobiolog i detta avseende. Live Hi inducerar ett starkare svar, medan dödade Hi-preparat och Hi-komponenter är mer standardiserade och är lätta...

Haemophilus influenzae (Hi) är en normal kommensal bakterie som finns i svalget hos de flesta friska vuxna. Hi kan ha en polysackaridkapsel (typ A-F, t.ex. typ B eller HiB) eller sakna kapsel och vara icke-skrivbar (NTHi)1. Kolonisering av slemhinnan med denna bakterie börjar i tidig barndom, och det finns en omsättning av olika koloniserande stammar2. Denna bakterie kan också invasionen av både övre och nedre luftvägarna; I detta sammanhang kan det inducera aktivering av immunsvaret och inflammation 3,4. Detta inflammatoriska svar kan orsaka klinisk sjukdom och bidra till en mängd viktiga andningsbesvär, inklusive bihåleinflammation, otitis media, bronkit, cystisk fibros, lunginflammation och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). De flesta av dessa förhållanden beror på NTHi-stammar2. Denna artikel kommer att beskriva metoder för att bedöma respiratoriska immunsvar mot Hi med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.
Metoderna som beskrivs nedan har anpassats från väletablerade tekniker som har modifierats för att bedöma det inflammatoriska svaret på Hi. Valet av en lämplig antigenform av Hi är en viktig del av denna bedömning. Antigena preparat sträcker sig från cellväggskomponenter till levande bakterier. För att upprätta och standardisera analyser kan användningen av perifera blodprover vara till stor hjälp initialt.
Flödescytometri möjliggör mätning av en mängd olika parametrar och funktionella analyser från ett prov på cellulär nivå. Denna teknik har fördelen att specifika cellulära svar (t.ex. produktion av reaktiva syrearter (ROS) eller intracellulär cytokinproduktion) kan bedömas jämfört med andra mer allmänna metoder såsom enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) eller ELISspot.
Extracellulära fällor uttrycks av neutrofiler (NET)5,6,7 och av andra celler såsom makrofager (METs)8. De erkänns alltmer som ett viktigt inflammatoriskt svar, särskilt vid infektion i lungan9. De kan bedömas med konfokal fluorescensmikroskopi. Denna teknik möjliggör definitiv identifiering av NET/METs och skiljer deras uttryck från andra former av celldöd6.
Både flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade analyser. Deras framgång är beroende av optimala töjningsprotokoll för biologiska prover. Dessa metoder tar lite tid att lära sig och kräver lämplig övervakningsexpertis. De inblandade instrumenten är också dyra både att köpa och driva. Den optimala inställningen för deras användning inkluderar stora universitet och tertiära remisssjukhus.
Metoderna som används i detta protokoll är överförbara för studier av andra liknande organismer som är involverade i andningssjukdomar (t.ex. Moxarella catarrhalis och Streptococcus pneumoniae). NTHi interagerar också med andra vanliga andningsbakterier10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>213330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD28</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>16-0289-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD49d</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>534048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI prolong gold</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHR123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109244-58-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filcon sterile nylon mesh</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin substrate, Enzchek</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>E12055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS mix tube rotater</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medimachine</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Catalogue number not available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicons 50 &#181;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>340592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pansorbin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>507858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8047152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost slides</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11562203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing respiratory immune responses to haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) är en utbredd bakterie som finns i en rad andningsbesvär. En mängd olika analyser/tekniker kan användas för att bedöma det respiratoriska immuna/inflammatoriska svaret på denna bakterie. Flödescytometri och konfokalmikroskopi är fluorescensbaserade tekniker som möjliggör detaljerad karakterisering av biologiska svar. Olika former av Hi-antigen kan användas, inklusive cellväggskomponenter, dödade / inaktiverade preparat och levande bakterier. Hej är en krånglig bakterie som kräver berikade medier men är i allmänhet lätt att odla i vanliga laboratoriemiljöer. Vävnadsprover för stimulering med Hi kan erhållas från perifert blod, bronkoskopi eller resekterad lunga (t.ex. hos patienter som genomgår kirurgi för behandling av lungcancer). Makrofag och neutrofil funktion kan utvärderas omfattande med hjälp av flödescytometri med en mängd olika parametrar uppmätta, inklusive fagocytos, reaktiva syrearter och intracellulär cytokinproduktion. Lymfocytfunktionen (t.ex. T-cells- och NK-cellfunktion) kan bedömas specifikt med hjälp av flödescytometri, främst för intracellulär cytokinproduktion. Hi-infektion är en potent inducerare av extracellulär fällproduktion, både av neutrofiler (NET) och makrofager (METs). Konfokalmikroskopi är utan tvekan det mest optimala sättet att bedöma NET- och MET-uttryck, som också kan användas för att bedöma proteasaktivitet. Lungimmunitet mot Haemophilus influenzae kan bedömas med hjälp av flödescytometri och konfokalmikroskopi.

De representativa resultaten visar hur inflammatoriska immunsvar mot NTHi kan bedömas/kvantifieras med flödescytometri och konfokalmikroskopi. En viktig del av tolkningen av resultaten är jämförelsen i fluorescens mellan kontroll och stimulerade prover. Ett antal preliminära experiment krävs vanligtvis för att optimera färgningen av prover. Hur många olika färger som kan undersökas samtidigt beror på antalet tillgängliga kanaler på flödescytometern/konfokalmikroskopet. Resultaten visas för bedömning av ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae at JoVE.com

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Haemophilus influenzae inducerar inflammation i luftvägarna. Denna artikel kommer att fokusera på användningen av flödescytometri och konfokalmikroskopi för att definiera immunsvar av fagocyter och lymfocyter som svar på denna bakterie.

Bedömning av respiratoriska immunsvar mot Haemophilus influenzae

Haemophilus influenzae (Hi) is a prevalent bacterium found in a range of respiratory conditions. A variety of different assays/techniques may be used to ...

Haemophilus influensa är en viktig orsak till inflammation i olika kroniska lungsjukdomar inklusive KOL och lunginflammation. Detta protokoll beskriver metoder för att bedöma effekten av hemofilus på lunginflammation. Fördelarna med denna teknik är att den möjliggör en omfattande bedömning av medfödda och adaptiva immunsvar.Inkubera 450 mikroliter perifert blod med 50 mikroliter av en aktiverad propidiumjodid märkt H influenzae i ett fem milliliter rör i 20 minuter i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Ta bort provet från vattenbadet, tillsätt fem mikroliter DHR och virvel i 10 sekunder. Placera sedan tillbaka den i vattenbadet i ytterligare 10 minuter.Efter att ha tagit bort provet från vattenbadet, lysera erytrocyterna med fem milliliter 0,8% ammoniumkloridlösning och analysera proverna på en flödescytometer som beskrivs i texten. Dela upp det perifera blodprovet i alikvoter för kontroll och antigenstimulering. Tillsätt kostimulatoriska antikroppar till båda proverna.Tillsätt sedan den icke-typbara H-influensan till antigenprovet och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i en timme. Tillsätt sedan Golgi-blockeringsmedlet brefeldin A till proverna och inkubera dem i ytterligare fem timmar. Efter lysering av erytrocyterna som visats tidigare, fixera leukocyterna med användning av 500 mikroliter av en till 2% para-formaldehyd i en timme.Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer, permeabilisera sedan 1 miljon celler med 100 mikroliter 0,1% saponin i 15 minuter. Därefter inkubera cellerna med lämpliga fluorescerande märkta antikroppar. Tvätta cellerna och analysera dem sedan med hjälp av en flödescytometer.Bestäm andelen antigensvarande celler genom att få relevanta lymfocytpopulationer. Utför bakgrundsfärgning på icke-stimulerade celler för alla cytokiner som ska analyseras. Skiva cirka 20 till 40 gram av lobektomiprovet i tre till fem kubikmillimeter sektioner.Placera dem i en steril 50 mikroliter kammare och fragmentera vävnaden mekaniskt med en lämplig disaggregator. Efter vävnadsuppdelning, lysera de röda blodkropparna som demonstrerats och återsuspendera cellerna i steril RPMI. Filtrera sedan cellerna genom ett 100 mikrometer sterilt nylonnät och räkna de livskraftiga cellerna med hjälp av trypanblå uteslutningsmetoden.För infektionsanalysen, återsuspendera lungcellerna i RPMI till en slutlig koncentration av 4 miljoner celler per milliliter per rör. Infektera sedan cellerna med en MOI på 100 bakterier per cell. Lossa locket en halv rotation för att tillåta gasöverföring i rören.Placera cellerna i rörrotatorn och inkubera dem vid 37 grader Celsius medan de roterar vid 12 varv / min. En timme efter stimulering, tillsätt grefeldin A för att förhindra extracellulär export av cytokiner och inkubera cellsuspensionerna i ytterligare 16 till 22 timmar med rotation. Följande dag, tvätta cellsuspensionen med 500 mikroliter PBS innehållande 1% bovint serumalbumin och 0,01% natriumazid.Därefter färga cellsuspensionen för specifika humana lymfocyter cellytmarkörer i en timme. Tvätta sedan cellerna med PBS och fixa och permeabilisera dem som visats tidigare. Därefter inkubera cellerna med intracellulära cytokinfärgningsantikroppar i en timme.Tvätta sedan cellerna och återsuspendera dem i 100 mikroliter PBS före datainsamling på en flödescytometer. Mät proteolys via verkan av metalloproteinaser, tillsätt fluoresceinmärkt gelatinsubstrat direkt på lungvävnadssektionsglasen. Placera bilderna horisontellt och inkubera dem i en ljusskyddad fuktad kammare vid 37 grader Celsius i en timme.För att förbereda negativa kontroller, lägg till en x reaktionsbuffert utan fluorescerande gelatin i sektionerna för vidare analys. Mononukleära celler i perifert blod gated med hjälp av framåt- och sidospridda för att definiera fagocytpopulationen. Fagocytpopulationen definierades ytterligare av CD14-uttryck för att märka monocyterna.ROS-mätning utfördes via oxidation av DHR 123 för att producera fluorescens. Medianfluorescensen för det stimulerade provet jämfördes med kontrollen. Intracellulär cytokinproduktion av lymfocyter mättes med hjälp av flödescytometri.Celler analyserades först för deras uttryck av leukocytmarkören CD45 och sedan för CD tre och CD fyra, CD åtta. CD-tre, CD fyra positiva celler bedömdes för intracellulär cytokinproduktion i kontroll och stimulerade prover. Protasaktivitet mättes med NC två zymografi i ofixerade lungvävnadssektioner.Fluorescerande färgning indikerade närvaron av MMP-aktivitet, som också samlokaliserades med uttrycket av kromatin. Att tillsätta antikroppar till lungvävnadsproverna kräver koncentration och färgning av cellerna kommer att kräva optimering i preliminära experiment. Supernatanten av lungvävnadsproverna kan analyseras ytterligare för andra inflammatoriska mediatorer med hjälp av tekniker som ELISA och Dessa tekniker kan användas för att bedöma effekten av potentiella terapier på lunginflammation.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Enzymkopplad immunospot analys (ELISPOT): Kvantifiering av TH-1 cellulära immunsvaret mot mikrobiella antigener

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Att mäta bakteriehalten och immunsvar hos möss som blivit infekterade med Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell för mätning av immunsvar mot malaria som led av HIV-infektion

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratrakeal administration<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musmodeller för att studera Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Använda Zebrafish Modeller av mänsklig influensa A-virus infektioner till skärm antivirala läkemedel och karakterisera värdens immuncellsvar

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...