Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

11- وتحظى منظمة "A.K. " بدعم من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة في المعونة لأغراض البحث العلمي (C) (#18K06201)، ومنحة معونة من مؤسسة ناكاتاني للتدابير المضادة ضد العدوى الجديدة بالفيروس التاجي، ومنحة من مكتب جامعة هوكايدو لتطوير قادة بحوث المستقبل (L-Station)، ومنحة مساعدة من مؤسسة هوانشا. 10 - وتحظى م. ك. بدعم جزئي من منحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات الابتكارية "كيمياء النظم الحيوية المتعددة الجزيئات التي تزاحم" (#20H04686)، ومنحة JSPS في المعونة للبحوث العلمية بشأن المجالات المبتكرة "فيزياء المعلومات للمسائل المعيشية" (#20H05522).

1. المواد والكواشف
<ol><li>استخدام الحلول الحرة بيراموجينيك والمتوسطة لثقافة الخلية (الجدول 1).</li>
	<li>إعداد حلول للتجربة الكيميائية الحيوية باستخدام المياه فائقة الشراء واستخدامها كما DNase / RNase الحرة.</li>
	<li>حدد FBS مناسبة لثقافة الخلية مع عملية الاختيار الكثير. وبما أن مجموعة FBS المحددة...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

وفيما يتعلق بمعايرة النظام قبل القياسات، ينبغي استخدام نفس الأواني الزجاجية المستخدمة لقياس العينة (على سبيل المثال، تغطي الآبار الثمانية الحجرة الزجاجية لليسات الخلية وطبق الأساس الزجاجي للخلايا الحية مقاس 35 ملم). بسبب الامتزاز من Rh6G على الزجاج، قد ينخفض تركيزها الفعال في بعض الأحيان. ?...

تجمعات البروتين التي تنطوي على اضطرابات عصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض الزهايمر, مرض باركنسون, مرض هنتنغتون, وهلم جرا1 ومن المعروف أن تكون سامة ومن شأنها أن تزعج التوازن البروتين (البروتيوستاسي) في الخلايا والأعضاء, التي يمكن أن تؤدي بعد ذلك إلى الشيخوخة2. ومن المتوقع إزالة البروتين تجميع كاستراتيجية علاجية; ومع ذلك، لم يتم بعد تحديد المواد الكيميائية التي تمنع تكوين البروتين وتتحلل مجاميع البروتين (مثل الجزيئات الصغيرة أو الأدوية). وعلاوة على ذلك، فإن كيفية ممارسة تجميع البروتين للسمية لا تزال بعيدة المنال. لذلك ، لتعزيز المشاريع البحثية المتعلقة بتجميع البروتين ، من المهم إدخال إجراءات عالية الإنتاجية للكشف ببساطة عن تجميع البروتين. الكشف عن تجميع البروتين باستخدام الأجسام المضادة التعرف على تشكيل تجميع البروتين وصبغ الفلورسنت تجميع محددة وقد استخدمت على نطاق واسع3. ومع ذلك ، من الصعب الكشف عن التجميع ، خاصة في الخلايا الحية باستخدام مثل هذه الإجراءات الكلاسيكية. 
Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) هو إجراء للكشف عن تجميع البروتين والتغيير الهيكلي. ومع ذلك ، فإن FRET غير قادر على تحليل ديناميات البروتين (على سبيل المثال ، نشر وoligomerization البروتين في الخلايا الحية)3. لذلك ، نقدم هنا بروتوكولا بسيطا للكشف عن تجميع البروتين في المحلول (على سبيل المثال ، lysate الخلية) والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يقيس خاصية الانتشار وسطوع جزيئات الفلورسنت مع حساسية جزيء واحد4. FCS هو طريقة العد الضوئي باستخدام المجهر confocal مسح الليزر (LSM). باستخدام كاشف فوتون حساس للغاية وحساب وظيفة التصحيح التلقائي (ACF) لوقت وصول الفوتون ، يتم قياس المرور عبر الوقت وسطوع جزيئات الفلورسنت في حجم الكشف. الانتشار يبطئ مع زيادة الوزن الجزيئي. وبالتالي، يمكن تقدير التفاعل بين الجزيئات باستخدام FCS. حتى أكثر قوة، زيادة في سطوع جزيء الفلورسنت يشير إلى المثلية-oligomerization من الجزيئات. ولذلك، FCS هو أداة قوية للكشف عن مثل هذا التجمع البروتين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) ومرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD) وما إلى ذلك. للكشف عن وتحليل أوليغومرات البروتين القابلة للذوبان أو المنتشرة أو المجاميع ، تم استخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) ، والذي يمكنه اكتشاف سرعة الانتشار وسطوع جسيم واحد مع حساسية جزيء واحد. ومع ذلك، لم يتم تقاسم الإجراءات والدراية المناسبة للكشف عن تجميع البروتين على نطاق واسع. هنا ، نعرض إجراء قياسيا لقياس FCS لخصائص الانتشار للبروتينات المعرضة للتراكم في lysate الخلية والخلايا الحية: ALS المرتبطة 25 kDa carboxyl-terminal جزء من TAR DNA / الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين 43 كيلودا (TDP25) وdismutase أكسيد 1 (SOD1). تظهر النتائج التمثيلية أن جزءا من مجاميع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسوم TDP25 تم تضمينه قليلا في الكسر القابل للذوبان من تحلل خلية الورم الأرومي العصبي المورفين Neuro2a. وعلاوة على ذلك ، GFP الموسومة SOD1 تحمل الطفرة المرتبطة ALS يظهر انتشار أبطأ في الخلايا الحية. وبناء على ذلك، نحن هنا نقدم الإجراء للكشف عن تجميع البروتين عن طريق خاصية نشرها باستخدام FCS.

لقد قمنا بقياس FCS ل GFP-TDP25 في lysate الخلية وSUD1-G85R-GFP في الخلايا الحية. وفي كلتا الحالتين، أمكن الحصول على سعة إيجابية وسلاسة في الصناديق الاستئمانية. لقد أظهرنا أن جزءا من GFP-TDP25 أعرب في خلايا Neuro2a تم استردادها في جزء قابل للذوبان تحت الشرط المشار إليه6. في جزء قابل للذوبان من lysate الخل...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

نحن هنا نقدم إجراء لقياس أوليغومر البروتين والتجميع في الخلايا lysate والخلايا الحية باستخدام التحليل الطيفي ارتباط مضان.

الكشف عن تجميع البروتين باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

تم اختراع أفضل مبدأ للتنظير الطيفي للارتباط الفلوري ، FCS ، في البداية في السبعينيات. في 1990s، تم إنشاء تحسينات هامة والعديد من لFCS من خلال الجمع مع المجهر جهاز confocal. ومنذ ذلك الحين، تم استخدام FCS للعديد من التطبيقات الكيميائية وعلاج الفيروسات، مثل التفاعلات الجزيئية وتحليل تجميع البروتين.تجميع البروتين هو السمة المميزة للاضطرابات العصبية. سطوع الفلورية هي جزيئات واحدة في العمل من الأحجام الجزيئية التي تفسرها خصائص الانتشار. من المهم جدا في قياس تجمعات البروتين لأنه يمكن تحديد دورات الحياة المتوقعة من الجزيئات، ولكن أيضا التمييز بين البلمرة المثلية أو الغيرية.هنا ، نقدم إجراء لقياس انتشار التصلب الجانبي الضموري المرتبط بروتين الشكل المجمع باستخدام FCS في lysates الخلية والخلايا الحية. إعداد 100 ملليمتر طبق من البلاستيك تنمو Neuro2a الخلية يجلس بشكل مريح في المتوسط النمو الطبيعي. تأكد من التقاء الخلية.إزالة الوسيطة. إضافة 3.5 ملليلتر من الحل تريبسين-EDTA في طبق خرطوشة الثالث واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. إضافة 9.5 ملليلتر متوسط النمو الطبيعي في الطبق وتعليقها.يتم خلط تعليق الخلية مع تريبان الأزرق لتلطيخ الخلايا الميتة. أضف التعليق إلى شريحة عد الخلايا. عد عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية، أو يدويا.تحقق من رقم الخلية الحية وقابليتها للاستمرار. تمييع الخلية في الوسط العد في 1.0 مرات 10 إلى قوة 5 لكل ملليلتر. إضافة اثنين من ملليلتر من تعليق الخلية في طبق من البلاستيك 35 ملليمتر لتحلل الخلية أو طبق مساحة النمو لقياس الخلايا الحية.احتضان الطبق في 37 درجة مئوية ليوم واحد. في اليوم التالي، وإعداد خليط من الحمض النووي البلازميد وواشف العدوى. أضف خليط العدوى إلى الوسط الذي تم عده بالخلايا واحتضن الخلايا لمدة 24 ساعة.بعد يوم واحد. تحقق من التعبير GFP باستخدام المجهر الروتيني. يمكنك أن ترى الجسم المكون TDP25 مشرق جدا في الخلايا.وينبغي إجراء تحلل الخلية في مقاعد البدلاء البيوكيميائية. إزالة المتوسطة في الطبق. إضافة اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني في 25 درجة مئوية لغسل كوسيلة.إزالة برنامج تلفزيوني. ضع الطبق على طبق من الألومنيوم على الجزء العلوي من الجليد المسحوق. على الفور، إضافة 200 ميكرولتر تحلل العازلة في الطبق.كشط الطبق باستخدام مكشطة الخلية. استعادة lysate مع حطام الخلية غير الملولوب في أنبوب جديد 1.5 ملليمتر. الطرد المركزي lysate في أربع درجات مئوية.بالنسبة لقياسات الخلايا الحية، استبدل الوسط بمقياس جديد قبل القياس. تحقق من مرفق الخلية باستخدام مجهر تباين المرحلة. تحقق أيضا من تعبير GFP باستخدام مجهر مضان.استخدم نظام FCS المجمع بالمجهر البؤري. قم بتشغيل ليزر 488 نانومتر. استقرار النظام، على الأقل، لمدة 30 دقيقة.إعداد المسار البصري. استخدم ليزر 488 نانومتر للضوء الفوري. استخدام مقسم شعاع المناسبة ومتر ديكهرويك.وأيضا، صمامات الفلورسينس. عادة، سوف نستخدم غرف coverglass للمعايرة وقياسات الحل. بعناية، واتخاذ غرفة coverglass.ضع السطح الزجاجي على ورق فحص العدسة. صب معايرة FCS. إضافة حل رودامين 6G في كذلك.إضافة المياه فائقة الشراء على الهدف. لا تستخدم الزيت. تعيين الغرفة على خشبة المسرح المجهر.نقل المرحلة إلى الموضع المناسب. قم بإنشاء تعديل الثقب وافتح معالج ضبط الثقب. مراقبة معدل العد فوتون كحركة الخشنة من الثقب لاتجاه س.وقد تم تحديد ألمع موقف عن حق. بعد ذلك، راقب معدل عدد الفوتونات كحركة دقيقة. تم تحديد ألمع موقف بنجاح هذا هو موقف الثقب لx-الاتجاه.وبنفس الطريقة، ابحث عن ألمع موضع للثقب بحثا عن اتجاه y. كما تم تحديد ألمع موقف لy-الاتجاه بنجاح. مركبة موقف س و ص من الثقب.فمن الأفضل لضبط موقف الثقب قبل قياس كل يوم. عند تغيير المسار المباشر، يجب تعديل موضع الثقب مرة أخرى. إنشاء معدل العد ومراقبة معدل عدد الهاتف.تغيير إلى وضع مراقبة CPM. عد حلقة تصحيح الكائن الذي قمت بتشغيله بحيث تكون قيمة CPM الأعلى. أغلق إطار معدل العد.ابدأ بقياس حل رودامين 6G. بعد الانتهاء من القياس، انقر فوق الملاءمة لإجراء تحليل تركيب المنحنى. حدد نموذجا لتركيب وظيفة الارتباط القديمة.بالنسبة لرودامين 6G، حدد النموذج لنشر مكون واحد ثلاثي الأبعاد مع حالة ثلاثية الأبعاد. تعيين وقت البدء المناسب عن طريق تحريك الخط الأحمر. انقر فوق احتواء الكل، لبدء الحساب المناسب.تحقق من انحراف الملاءمة. تأكد من أن يتم نشر الجانبين والسلبية، حول الصفر. تحقق من القيم المجهزة.تأكد من أن وقت الانتشار هو تقريبا في نطاق من 20-30 ميكروثانية. وعلاوة على ذلك، المعلمة الهيكلية من أربعة إلى ثمانية. افتح لوحة الملاءمة، وحدد نموذجا للقياس.أدخل نفس قيمة المعلمة الهيكلية في نموذج العينة في لوحة الملاءمة. تأكد من تعيين النوع ك ثابت. قياس GFP-TDP25 في lysate الخلية.ضع ال lysate في غرفة زجاج الغطاء. ضع الغطاء لتجنب جفاف الليزات. ضع غطاء المسرح للتظليل الخفيف.في لوحة الاستحواذ، قم بتعيين قوة الليزر ووقت القياس وتكرارها. بدء عملية الاستحواذ. ولوحظ ارتفاع.ولوحظ ارتفاع مرة أخرى. يشير الارتفاع إلى جزيئات ساطعة مرت عبر جسم الكشف. المسامير تشير إلى أوليغومرات قابلة للذوبان أو المجاميع.قم بإنشاء نوبة لإجراء تحليل تركيب المنحنى. حدد النموذج لنشر مكونين وثلاثي الأبعاد مع الحالة الثلاثية. تعيين وقت البدء المناسب.انقر فوق احتواء الكل. تحقق من القيم المجهزة. SOD1-G85R الموسومة مع قياس GFP في خلية حية.على عكس قياس الحل ، أوصي باستخدام حاضنة مرحلة الحرارة. تعيين طبق زراعة الخلايا على خشبة المسرح المجهر. تأكد من التركيز والموضع باستخدام العين.حدد خلية قياس. تكبير وضبط موضع الخلية باستخدام وضع المسح السريع. الحصول على لقطة من الخلايا باستخدام وضع سرعة المسح الضوئي بطيئة.حدد موضع قياس FCS باستخدام أداة الموضع. يشير التقاطع إلى موضع القياس. بدء القياس.يشير الانخفاض الطفيف في سجل معدل عدد فوتون إلى bleaching ضوئية ل GFP. تنفيذ منحنى المناسب. تظهر النتائج التمثيلية ل GFP-TDP25 في lysate الخلية.الرسم البياني العلوي سجل معدل عدد فوتون. حيث هناك السهام هو ارتفاع، مما يشير إلى أوليغومرات قابلة للذوبان والمجاميع. يمثل الرسم البياني الأوسط دالة الارتباط القديمة.يظهر الخط الرمادي دالة الارتباط القديمة المنخفضة. يظهر خط أرجواني الدالة المجهزة. تشير الخطوط المنقطة إلى أوقات البدء والنهاية للتركيب.يعرض الجدول السفلي القيمة المجهزة. بعد ذلك، تظهر النتائج التمثيلية ل SOD1-G85R-GFP في خلية حية. يمثل الرسم البياني العلوي سجلا لمعدل عدد فوتوناتنا.ولوحظ الانخفاض التدريجي في معدل العد المسجل للفوتوان، مما يشير إلى زيادة معدل GFP بالنسبة لقياسات مختلفة. وذلك بسبب سرعة الانتشار البطيء في الخلايا الحية. يمثل الرسم البياني الأوسط دالة الارتباط القديمة ل SOD1.يظهر الخط الرمادي دالة الارتباط القديمة المنخفضة. يظهر خط أرجواني الدالة المجهزة. تشير الخطوط المنقطة إلى أوقات البداية والنهاية مع التركيب.يعرض الجدول السفلي القيم المجهزة. هنا نعرض لكم هذا الإجراء لقياس الانتشار من كل خلية المرتبطة TDP-25 في lysate الخلية وكل شيء متحولة من SOD1 في الخلايا الحية باستخدام FCS. يمكن ملاحظة أوليغومرات القابلة للذوبان والتجميع في ليسات الخلية في كثير من الأحيان كما طفرات أو رشقات نارية.من ناحية أخرى ، في الخلايا الحية ، نادرا ما يلاحظ مثل هذه المسامير ، باستثناء الهياكل الحية الواضحة. وهناك أنواع نشر ببطء من SOD1 متحولة إضافة يعني سطوع لجزيئات واحدة مثل SOD1 homopolymerization داخل بالنسبة لنا. الإجراء المبين هنا بسيط وجدير بالاهتمام.FCS لا يحتوي على الإشعاع؛ حالة نائمة مباشرة. انها مجرد الخاص بك، ولدينا، التعاطف الخيال.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

اكتشاف بروتين Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

في الجسم الحي ، الكشف عن البروتين البروتين التفاعلات على مايكرو نقوش السطوح

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

من السهل قياس إنتشار معاملات EGFP الموسومة البروتينات عن طريق غشاء البلازما ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...