Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

A.K.得到了日本科学促进会（JSPS）科研补助金（C）（#18K06201）的支持，得到了中田尼预防新型冠状病毒感染对策基金会的资助，得到了北海道大学未来研究领导者发展办公室（L-Station）的资助，以及Hoansha基金会的赠款援助。M. K. 部分得到了 JSPS 创新领域"多分子拥挤生物系统化学"（#20H04686）和 JSPS 创新领域"生物物质信息物理"（#20H05522）科学研究资助部分支持。

1. 材料和试剂
<ol><li>使用热源性免费解决方案和细胞培养介质 （表 1）。</li>
	<li>使用超纯水为生化实验准备解决方案，并作为无 DNase/RNase 使用。</li>
	<li>选择适合细胞培养的 FBS，并具有大量的检查过程。由于所选的 FBS 批次会定期更改，此处无法在此处表示 FBS 的目录和批号。</li>
	<li>普拉斯米德DNA<ol>
<li>为电子GFP单体表达准备pmeGFP-N15; pmeGFP-C1-TDP256</...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

关于测量前的系统校准，应使用与用于测量样品的玻璃器皿相同的玻璃器皿（例如，8 井盖玻璃室用于细胞测定，35 毫米玻璃底盘用于活细胞）。由于 Rh6G 吸附在玻璃上，其有效浓度有时可能会降低。如果是这样，应该只用于针孔调整的高度浓缩 Rh6G 解决方案，如 1 μM。必须避免极高的光子计数率以保护探测器（例如，超过 1000 kHz）。此外，集中解决方案不适用于获取自动关系功能（保持小于 100 ...

蛋白质聚集涉及神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS），阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈症等1 已知是有毒的，并会扰乱蛋白质平衡（蛋白酶），然后可能导致老化2。蛋白质聚集的清除有望作为一种治疗策略：然而，防止蛋白质聚集形成和降解蛋白质聚合物（如小分子或药物）的化学物质尚未确定。此外，蛋白质聚合如何产生毒性仍然难以捉摸。因此，为了促进与蛋白质聚集相关的研究项目，必须引入高吞吐量程序，以简单地检测蛋白质聚合。蛋白质聚合检测使用抗体识别蛋白质聚合和聚合特异性荧光染料的一致性已被广泛使用3。然而，很难检测聚合，特别是在使用这种经典程序的活细胞中。 
弗斯特共振能量转移 （FRET） 是检测蛋白质聚合和结构变化的程序。然而，FRET无法分析蛋白质动力学（例如，活细胞中蛋白质的扩散和寡聚化）3。因此，我们在这里引入了一个简单的协议，使用荧光相关光谱（FCS）检测溶液（如细胞裂解）和活细胞中的蛋白质聚合，该光谱学测量荧光分子的扩散特性和亮度，具有单分子灵敏度4。FCS 是一种使用激光扫描对焦显微镜 （LSM） 进行光子计数的方法。利用高度灵敏的光子探测器和光子到达时间的自相关函数（ACF）计算，测量检测体积中荧光分子的通过时间和亮度。随着分子量的增加，扩散速度变慢：因此，可以使用 FCS 估计分子间相互作用。更有力的是，荧光分子亮度的增加表明分子的同质化。因此，FCS 是检测此类蛋白质聚合的强大工具。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

蛋白质聚集是神经退行性疾病（如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）、阿尔茨海默病 （AD）、帕金森病 （PD）、亨廷顿舞蹈症 （HD） 等的标志。为了检测和分析可溶性或扩散的蛋白质寡聚物或聚合物，已经使用了荧光相关光谱（FCS），它可以检测具有单分子灵敏度的单个粒子的扩散速度和亮度。然而，蛋白质聚合检测的适当程序和专有知识尚未得到广泛推广。在这里，我们展示了FCS测量细胞裂解和活细胞中容易聚集的蛋白质扩散特性的标准程序：TAR DNA/RNA结合蛋白43 kDa（TDP25）和超氧化物分解酶1（SOD1）的ALS相关25 kDa盒式终端片段。代表性结果表明，绿色荧光蛋白（GFP）标签TDP25的聚合部分被稍微包含在穆林神经母细胞神经母细胞核糖核酸的可溶性部分。此外，带有ALS相关突变的GFP标记SD1显示活细胞的扩散速度较慢。因此，我们介绍使用FCS通过其扩散特性检测蛋白质聚合的程序。

我们在活细胞中对细胞裂解剂中的GFP-TDP25和SOD1-G85R-GFP进行了FCS测量。在这两种情况下，都能够获得正振幅和光滑的ACF。我们已经表明，在神经2a细胞中表达的GFP-TDP25的一部分在指示条件6下的可溶性部分被恢复。在细胞裂解物的可溶性部分，使用FCS（图2A，顶部，箭头）在光子计数速率记录中检测到极亮的荧光分子。在GFP单体和单散射化学荧光染料溶液中未?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

我们在这里介绍了一个程序，以测量蛋白质寡聚物和聚合在细胞溶解和活细胞使用荧光相关性光谱。

使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

荧光相关光谱的最佳原理FCS最初是在20世纪70年代发明的。在20世纪90年代，通过与共焦仪器显微镜相结合，对FCS建立了重要和许多改进。自那时以来，FCS 已用于许多化学和病毒治疗应用，如分子相互作用和蛋白质聚合分析。蛋白质聚集是神经退行性疾病的标志。荧光亮度是分子大小的单粒子，由扩散特性解释。它对于测量蛋白质聚合非常重要，因为它可以确定分子的预计生命周期，还可以区分同质化或异质聚合。在这里，我们介绍了一个程序，以测量与聚合形式蛋白相关的肌萎缩性侧索硬化症的扩散，使用FCS在细胞裂解剂和活细胞。准备100毫米塑料盘生长神经2a细胞舒适地坐在正常的生长介质。确认细胞的汇流。删除介质。将 3.5 毫升的 Trypsin-EDTA 溶液添加到第三个墨盒盘中，并在 37 摄氏度下孵育一分钟。将 9.5 毫升的正常生长介质加入菜中并暂停。细胞悬架与尝试盘蓝色混合，以染色死细胞。将悬架添加到单元计数幻灯片中。使用细胞计数器或手动计算细胞数量。检查活细胞编号及其生存能力。将计数介质中的细胞稀释为 1.0 倍 10 到每毫升 5 的功率。在 35 毫米塑料盘中加入两毫升细胞悬浮，用于细胞裂解或生长空间盘，用于活细胞测量。在37摄氏度下孵化这道菜一天。第二天，准备质粒DNA和转染试剂的混合物。将转染混合物添加到细胞计数介质中，并孵育细胞 24 小时。一天后使用常规显微镜检查 GFP 表达式。你可以看到细胞中非常明亮的TDP25成分体。细胞裂解应在生化台进行。取出盘中的介质。在 25 摄氏度下加入两毫升 PBS，作为介质清洗。删除 PBS。将盘子放在碎冰顶部的铝板上。立即将 200 微滑解缓冲器添加到菜中。用细胞刮刀刮盘子。在新的1.5毫米管中用未溶解的细胞碎片回收溶解物。在摄氏四度的离心解体。对于活细胞测量，在测量前用新的介质替换介质。使用相位对比显微镜检查细胞附件。此外，使用荧光显微镜检查 GFP 表达式。使用共焦显微镜组合FCS系统。打开488纳米激光。稳定系统至少30分钟。设置光学路径。使用 488 纳米激光进行即时照明。使用适当的光束分路器和分光计。还有荧光保险丝通常，我们将使用盖玻璃室进行校准和溶液测量。小心，拿盖玻璃室。将玻璃表面放在透镜筛选纸上。倒入FCS校准。在中加入罗达明 6G 解决方案。在目标上加入超纯水。不要使用油。将腔室设置在显微镜舞台上。将舞台移动到适当的位置。创建针孔调整并打开针孔调整向导。监控光子计数速率，作为 x 方向针孔的粗移动。最亮的位置是正确确定的。接下来，将光人计数率监控为精细运动。最亮的位置被成功确定这是 x 方向的针孔位置。同样，搜索针孔最亮的位置以查找 y 方向。y 方向最亮的位置也成功确定。复合针孔的 x 和 y 位置。最好在每天测量前调整针孔位置。更改实时路径时，必须再次调整针孔位置。创建计数速率并监控电话计数速率。更改为 CPM 监控模式。计算您运行的对象的校正环，以便 CPM 值最高。关闭计数速率窗口。从罗达明 6G 解决方案测量开始。测量完成后，单击适合执行曲线拟合分析。选择一个模型来安装旧的相关函数。对于罗达明 6G，选择具有三胞胎状态的 1 组件、3 维扩散模型。通过移动红线设置合适的启动时间。单击"适合所有人"，开始安装计算。检查拟合偏差。确保双方被张贴和负，大约为零。检查合适的值。确保扩散时间大致在 20-30 微秒之间。此外，结构参数为 4 到 8。打开拟合面板，并选择测量模型。在拟合面板中输入模型中样本的相同结构参数值。确保类型应设置为固定。GFP-TDP25在细胞测得。将利萨特放在盖玻璃室中。放置盖子以避免赖酸干涸。将舞台盖放在浅色阴影上。在采集面板中，设置激光功率、测量时间及其重复性。开始收购。观察到一个尖峰。再次观察到尖峰。尖峰表示通过检测体的明亮分子。尖峰表示可溶性寡头或聚合物。创建适合执行曲线拟合分析。选择具有三元状态的 2 组件三维扩散模型。设置合适的开始时间。单击"适合所有"。检查合适的值。SOD1-G85R 在活细胞中标有 GFP 测量标签。与溶液测量不同，我建议使用热阶段孵化器。将细胞培养盘设置在显微镜舞台上。使用眼部确认焦点和位置。选择测量单元。使用快速扫描模式放大和调整单元位置。使用慢速扫描速度模式获取单元格快照。使用位置工具选择 FCS 测量位置。十字线表示测量位置。开始测量。光子计数率记录的轻微下降表明GFP的光漂白。执行曲线拟合。显示了细胞糖酸盐中GFP-TDP25的代表性结果。上图记录了光子计数速率。箭头的位置是尖峰，表示可溶性寡头和聚合物。中间图表示旧的相关函数。灰色线显示低、旧相关函数。洋红色线显示安装的功能。虚线表示安装的开始和结束时间。下表显示拟合值。接下来，在活细胞中显示 SOD1-G85R-GFP 的代表性结果。上图表示我们光子计数率的记录。记录的光子计数率逐渐下降，表明不同测量的GFP增长的光漂白。这是因为活细胞的扩散速度很慢。中间图表示 SOD1 的旧相关函数。灰色线显示低、旧相关函数。洋红色线显示安装的功能。虚线表示适合的开始和结束时间。下表显示合适的值。在这里，我们向您展示此程序，以测量来自细胞裂解液中每个细胞相关 TDP-25 的扩散，以及使用 FCS 在活细胞中 SOD1 的一切突变。细胞裂解物中的可溶性寡聚物和聚合通常可观察到尖峰或爆裂。另一方面，在活细胞中，除了可能明显的活体结构外，很少观察到这种尖峰。变异SAD1的缓慢扩散物种为我们内部的单个粒子（如SAD1均匀化）增加了均值亮度。此处显示的程序简单且值得。FCS不含辐射，直接处于休眠状态。这只是你和我们的想象力的同理心。

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

蛋白泛素化的检测

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

科研

生物学

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

液相恢复GELFREE 8100分馏系统使用基于分子量分馏

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

双分子荧光互补（附设）检测蛋白质相互作用的洋葱细胞使用的Helios基因枪

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

微图案的表面上的蛋白质-蛋白质相互作用的体内检测

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

从细胞中一氧化氮和超氧负离子自由基的电子顺磁共振光谱的检测，使用自旋陷阱

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

使用网关兼容双分子荧光互补（附设）系统在植物蛋白相互作用检测

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

脂筏的测定分区在活细胞中的荧光标记探针的荧光相关光谱（FCS）

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

荧光检测病毒RNA<em&gt;原位</em&gt;杂交（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

在活细胞中蛋白质聚集的4D成像

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

绿色荧光蛋白标记的质膜蛋白质的扩散系数的简易测量采用K空间图像相关光谱

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...