Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

A.K. blev støttet af en Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), af et tilskud-in-aid fra Nakatani Foundation for Countermeasures mod nye coronavirus infektioner, med et tilskud fra Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station), og et tilskud-in-aid fra Hoansha Foundation. M. K. blev delvist støttet af en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) og en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).

1. Materialer og reagenser
<ol><li>Brug pyrogene frie opløsninger og medium til cellekultur(tabel 1).</li>
	<li>Forbered løsninger til det biokemiske eksperiment ved hjælp af ultrapure vand og brug som DNase / RNase gratis.</li>
	<li>Vælg en passende FBS til cellekulturen med en lotkontrolproces. Da det valgte FBS-parti ændres regelmæssigt, kan kataloget og lotnummeret for FBS ikke repræsenteres her.</li>
	<li>Plasmid DNA<ol>
<li>Forbered pmeGFP-N15 til monomert eGFP-udtr...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

Med hensyn til systemkalibrering før målinger bør der anvendes de samme glasvarer som det, der anvendes til måling af prøven (f.eks. skal glaskammeret med 8 brønde til cellelysat og 35 mm glasbasisretten til levende celler anvendes). På grund af adsorptionen af Rh6G på glasset kan dens effektive koncentration undertiden falde. Hvis det er tilfældet, bør en stærkt koncentreret Rh6G-opløsning som 1 μM kun anvendes til justering af pinhole. Ekstremt høje antal fotonhastigheder skal undgås for at beskytte dete...

Proteinsammenlægninger, der involverer neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, Huntingtons Sygdom og så videre1 er kendt for at være giftige og ville forstyrre proteinhomostase (proteostase) i celler og organer, som derefter kan føre tilaldring 2. Rydning af proteinsammenlægning forventes som en terapeutisk strategi; Der er dog endnu ikke etableret kemikalier, der forhindrer dannelse af proteinsammenlægning og nedbryder proteinaggregater (f.eks. små molekyler eller lægemidler). Desuden er det stadig vanskeligt at finde ud af, hvordan proteinsammenlægning udøver toksicitet. For at fremme forskningsprojekter i forbindelse med proteinsammenlægning er det derfor vigtigt at indføre procedurer for høj overførselshastighed for blot at detektere proteinsammenlægning. Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af antistoffer, der anerkender overensstemmelsen af proteinsammenlægning og aggregeringsspecifikt fluorescerende farvestof, er blevet anvendt i vid udstrækning3. Det er dog vanskeligt at opdage sammenlægningen, især i levende celler ved hjælp af sådanne klassiske procedurer. 
Förster resonans energioverførsel (FRET) er en procedure til påvisning af proteinsammenlægning og strukturelle ændringer. FRET er imidlertid ikke i stand til at analysere proteindynamik (f.eks. diffusion og oligomerisering af protein i levende celler)3. Derfor introducerer vi her en simpel protokol til påvisning af proteinsammenlægning i opløsning (f.eks. celle lysat) og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som måler diffusionsegenskaben og lysstyrken af fluorescerende molekyler med enkeltmolekylefølsomhed4. FCS er en foton-tælle metode ved hjælp af en laserscanning confocal mikroskop (LSM). Ved hjælp af en meget følsom fotondetektor og beregning af autokorrelationsfunktion (ACF) af foton ankomsttid måles gennemløbstiden og lysstyrken af fluorescerende molekyler i detektionsvolumen. Diffusionen aftager med en forøgelse af molekylvægten; Således kan intermolekylær interaktion estimeres ved hjælp af FCS. Endnu mere kraftfuldt indikerer en stigning i lysstyrken af fluorescerende molekyle homo-oligomerisering af molekylerne. Derfor er FCS et kraftfuldt værktøj til at opdage en sådan proteinsammenlægning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

Proteinsammenlægning er kendetegnende for neurodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntingtons Sygdom (HS) osv. For at detektere og analysere opløselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater er der anvendt fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektere diffusionshastigheden og lysstyrken af en enkelt partikel med en enkelt molekylefølsomhed. Den korrekte procedure og knowhow til registrering af proteinsammenlægning er imidlertid ikke blevet udbredt. Her viser vi en standardprocedure for FCS-måling for diffusionsegenskaber af aggregerings-tilbøjelige proteiner i celle lysat og levende celler: ALS-associeret 25 kDa carboxyl-terminalfragment af TAR DNA/ RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoxid dismutase 1 (SOD1). De repræsentative resultater viser, at en del af aggregaterne af grønt fluorescerende protein (GFP)-mærket TDP25 var lidt inkluderet i den opløselige fraktion af murine neuroblastoma Neuro2a celle lysat. Desuden viser GFP-mærket SOD1 med ALS-associeret mutation en langsommere diffusion i levende celler. Derfor introducerer vi her proceduren til påvisning af proteinsammenlægningen via dens diffusionsegenskab ved hjælp af FCS.

Vi udførte FCS måling af GFP-TDP25 i celle lysat og SOD1-G85R-GFP i levende celler. I begge tilfælde var en positiv amplitude og glatte ACF'er i stand til at erhverves. Vi har vist, at en del af GFP-TDP25 udtrykt i Neuro2a celler blev genvundet i opløselige fraktion under den angivne betingelse6. I den opløselige del af cellelysatet blev der påvist ekstremt lyse fluorescensmolekyler i fotontællingsrekorden ved hjælp af FCS (Figur 2A, top, pil). Sådanne "pigge...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Vi introducerer her en procedure til måling af protein oligomerer og sammenlægning i celle lysat og levende celler ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi.

Påvisning af proteinsammenlægning ved hjælp af fluorescenskorrelationsspektroskopi

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Det bedste princip i Fluorescenskorrelationsspektroskopi, FCS, blev oprindeligt opfundet i 1970'erne. I 1990'erne blev der etableret vigtige og mange forbedringer for FCS ved at kombinere med en konfokal apparatmikroskopi. Siden da har FCS været brugt til mange kemiske og virus helbrede applikationer, såsom molekylære interaktioner og protein sammenlægning analyse.Proteinsammenlægning er kendetegnende for neurodegenerative lidelser. Lysstyrken lysstyrke er enkelte partikler i virkning af molekylære størrelser forklaret af diffusion egenskaber. Det er meget vigtigt at måle proteinsammenlægninger, fordi det kan bestemme forventede livscyklus for molekyler, men også skelne mellem homo eller hetero polymerisering.Her introducerer vi en procedure til måling af diffusion af amyotrofisk lateral sklerose forbundet med aggregeret formprotein ved hjælp af FCS i cellelysater og levende celler. Forbered 100 millimeter plast parabol voksende Neuro2a celle sidder komfortabelt i den normale vækst medium. Bekræft cellekonfluens.Fjern mediet. Tilsæt 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-opløsning i den tredje patronskål og inkuber dem ved 37 grader celsius i et minut. Tilsæt 9,5 milliliter normal vækst medium i fadet og suspendere dem.Celleaffjedringen blandes med trypanblå for at plette de døde celler. Føj affjedring til celleoptællingsdiaset. Tæl antallet af celler ved hjælp af celletælleren, eller manuelt.Tjek det levende cellenummer og deres levedygtighed. Cellen fortyndes i det optalte medium ved 1,0 gange 10 til en effekt på 5 pr. milliliter. Tilsæt to milliliter celleaffjedring i 35 millimeter plastfad til celle lysis eller vækstrumsskål til måling af levende celler.Inkuber skålen ved 37 grader celsius i en dag. Den næste dag skal du forberede blandingen af plasmid DNA og transfekturereagenserne. Tilsæt transfektblandingen til det celleoptalte medie, og inkubter cellerne i 24 timer.En dag senere. Kontroller GFP-udtrykket ved hjælp af et rutinemæssigt mikroskop. Du kan se de meget lyse TDP25 ingrediens organer i celler.Celle lysis skal udføres på den biokemiske bænk. Fjern mediet i skålen. Tilsæt to milliliter PBS ved 25 grader celsius for at vaske som et medium.Fjern PBS. Placer skålen på en aluminium plade på toppen af den knuste is. Tilsæt straks 200 mikroliter lysis bufferen i skålen.Skrab skålen ved hjælp af en celleskraber. Gendan lysatet med uopløste cellerester i et nyt 1,5 millimeter rør. Centrifuge lysatet ved fire grader celsius.Til målinger af levende celler skal mediet udskiftes med et nyt før målingen. Kontroller den vedhæftede fil i cellen ved hjælp af et mikroskop med fasekontrast. Kontroller også GFP-udtrykket ved hjælp af et fluorescensmikroskop.Brug et confocal mikroskop-kombineret FCS-system. Tænd for 488 nanometerlaseren. Stabilisere systemet, i det mindste, i 30 minutter.Konfigurer den optiske sti. Brug en 488 nanometer laser til det øjeblikkelige lys. Brug en passende stråle splitter og dichroic meter.Og også fluorescens fusers. Normalt bruger vi coverglaskamre til kalibrering og løsningsmålinger. Forsigtigt, tage coverglass kammer.Placer glasoverfladen på linsescreeningspapiret. Hæld FCS kalibrering. Tilsæt også Rhodamine 6G-opløsningen.Tilsæt ultrapure vand på målet. Brug ikke olien. Sæt kammeret på mikroskop scenen.Flyt stadiet til den relevante position. Opret justeringen af pinhole, og åbn guiden til justering af pinhole. Overvåg fotontællingshastigheden som grov bevægelse af pinhole for x-retningen.Den lyseste position blev med rette bestemt. Derefter skal du overvåge fotontællingshastigheden som fin bevægelse. Den lyseste position blev bestemt Med succes Dette er pinhole position for x-retning.På samme måde skal du søge i pinholets lyseste position efter y-direction. Den lyseste position for y-direction blev også med succes bestemt. Sammensatte x og y position pinhole.Det er bedre at justere pinhole position før hver dags måling. Når den strømførende sti ændres, skal pinhole-positionen justeres igen. Opret en optællingsrate, og overvåg telefontællingsfrekvensen.Skift til CPM-overvågningstilstand. Tæl rettelsesringen for det objekt, du kørte, så CPM-værdien er den højeste. Luk vinduet optællingshastighed.Start med Rhodamine 6G-opløsningsmålingen. Når målingen er fuldført, skal du klikke på for at udføre kurvetilpasningsanalyse. Vælg en model til tilpasning af den gamle korrelationsfunktion.For Rhodamine 6G skal du vælge modellen for 1-komponent, 3-dimensionel diffusion med en triplet tilstand. Indstil starttidspunktet for tilpasningen ved at flytte den røde linje. Klik på Tilpas til alle for at starte tilpasningsberegningen.Kontroller tilpasningsafvigelsen. Sørg for, at siderne er udstationeret og negative, omkring nul. Kontroller de monterede værdier.Sørg for, at diffusionstiden er omtrent i intervallet fra 20-30 mikrosekunder. Desuden er strukturelle parametre fra fire til otte. Åbn tilpasningspanelet, og vælg en model til målingen.Angiv den samme strukturelle parameterværdi i modellen for eksemplet i fit-panelet. Sørg for, at typen skal angives som Fast. GFP-TDP25 måling i celle lysat.Placer lysatet i dækglaskammeret. Læg låget på for at undgå udtørring af lysatet. Placer scenelåget for lysskygge.I anskaffelsespanelet skal du indstille lasereffekten, måletiden og gentagelserne. Start købet. En spike blev observeret.En spike blev observeret igen. Spiken indikerer lyse molekyler passeret gennem detektionskroppen. Pigge angiver opløselige oligomerer eller aggregater.Opret en pasform til at udføre kurvetilpasningsanalyse. Vælg modellen til 2-komponent, 3-dimensionel diffusion med triplet tilstand. Indstil starttidspunktet for tilpasningen.Klik på Tilpas alle. Kontroller de monterede værdier. SOD1-G85R mærket med GFP-måling i en levende celle.I modsætning til løsningsmåling anbefaler jeg at bruge inkubatoren til varmestadiet. Sæt celle-dyrkning parabol på mikroskop scenen. Bekræft fokus og position ved hjælp af okulær.Marker en målecelle. Zoom ind, og juster cellepositionen ved hjælp af en hurtig scanningstilstand. Hent øjebliksbilledet af cellerne ved hjælp af tilstanden med langsom scanningshastighed.Vælg en FCS-måleposition ved hjælp af positionsværktøjet. Trådkorset angiver målepositionen. Start målingen.Det lille fald i fotontalsrekorden antyder fotobleaching af GFP. Udfør kurvetilpasningen. Repræsentative resultater af GFP-TDP25 i celle lysat er vist.Den øverste graf en registrering af photon tælle sats. Hvor der er pile er en spike, tyder opløselige oligomerer og aggregater. Den midterste graf repræsenterer den gamle korrelationsfunktion.Den grå linje viser den lave, gamle korrelationsfunktion. Magentalinjen viser den monterede funktion. De syltede linjer angiver start- og sluttidspunkterne for montering.Den nederste tabel viser den monterede værdi. Dernæst vises repræsentative resultater af SOD1-G85R-GFP i en levende celle. Den øverste graf repræsenterer en registrering af vores fotontællingsrate.Det gradvise fald i den registrerede fotontællingsrate blev observeret, hvilket tyder på fotobleaching af GFP-vækst for forskellige målinger. Dette skyldes den langsomme diffusionshastighed i levende celler. Den midterste graf repræsenterer sod1's gamle korrelationsfunktion.Den grå linje viser den lave, gamle korrelationsfunktion. Magentalinjen viser den monterede funktion. De syltede linjer angiver start- og sluttidspunkterne med montering.Den nederste tabel viser monterede værdier. Her viser vi dig denne procedure til måling af diffusion fra hver celle associeret TDP-25 i celle lysat og alt mutant af SOD1 i levende celler ved hjælp af FCS. De opløselige oligomerer og sammenlægning i celle lysat kan ofte observeres som pigge eller brister.På den anden side observeres sådanne pigge i levende celler sjældent, bortset fra muligvis åbenlyse levende strukturer. En langsomt spredende art af mutant SOD1's tilføje gennemsnitlig lysstyrke for enkelte partikler såsom SOD1 homopolymerisering inde for os. Den procedure, der vises her, er enkel og umagen værd.FCS indeholder ingen stråling;direkte sovende tilstand. Det er bare din og vores fantasi empati.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Påvisning af nitrogenoxid og superoxid Radical anion ved elektron paramagnetisk resonans-spektroskopi fra celler under anvendelse Spin Fælder

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestemmelse af lipidklump opdeling af fluorescens-mærkede prober i levende celler ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning af viralt RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging af proteinaggregering i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Nem Måling af diffusionskoefficienter af EGFP-tagget plasmamembranproteiner Brug k-Space Billede korrelationsspektroskopi

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...