Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
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A.K. wurde von einer Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), durch ein Stipendium der Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, durch ein Stipendium des Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) und ein Stipendium der Hoansha Foundation unterstützt. M. K. wurde teilweise durch ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686) und ein JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information Physics of living matters" (#20H05522) unterstützt.

1. Materialien und Reagenzien
<ol><li>Verwenden Sie pyrogene freie Lösungen und Medium für die Zellkultur (Tabelle 1).</li>
	<li>Bereiten Sie Lösungen für das biochemische Experiment mit Reinstwasser vor und verwenden Sie als DNase/RNase frei.</li>
	<li>Wählen Sie einen geeigneten FBS für die Zellkultur mit einem Chargenprüfungsprozess aus. Da sich das ausgewählte FBS-Los regelmäßig ändert, können der Katalog und die Chargennummer für FBS hier nicht dargestellt werden.</li>
	<li>Plasmid-DN...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

In Bezug auf die Systemkalibrierung vor Messungen sollten die gleichen Glaswaren verwendet werden, die zur Messung der Probe verwendet wurden (z. B. die 8-Wells-Abdeckungglaskammer für Zelllysat und die 35-mm-Glas-Basisschale für lebende Zellen). Aufgrund der Adsorption von Rh6G auf dem Glas kann seine effektive Konzentration manchmal abnehmen. In diesem Fall sollte eine hochkonzentrierte Rh6G-Lösung, wie z. B. 1 m, nur für die Lochverstellung verwendet werden. Zum Schutz des Detektors (z. B. mehr als 1000 kHz) müss...

Proteinaggregationen mit neurodegenerativen Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, und so weiter1 sind als toxisch bekannt und würden Proteinhomöostase (Proteostase) in den Zellen und Organen stören, die dann zum Altern führen könnte2. Die Clearance der Proteinaggregation wird als therapeutische Strategie erwartet; Chemikalien, die die Bildung von Proteinaggregationen verhindern und Proteinaggregate abbauen (z. B. kleine Moleküle oder Medikamente), sind jedoch noch nicht etabliert. Darüber hinaus bleibt die Art und Weise, wie die Proteinaggregation Toxizität ausübt, schwer fassbar. Daher ist es zur Förderung von Forschungsprojekten im Zusammenhang mit der Proteinaggregation wichtig, Verfahren mit hohem Durchsatz einzuführen, um die Proteinaggregation einfach zu erkennen. Der Proteinaggregationsnachweis mit Antikörpern, die die Konformation von Proteinaggregation und aggregationsspezifischem Fluoreszenzfarbstoff erkennen, wurde weit verbreitet3. Es ist jedoch schwierig, die Aggregation zu erkennen, insbesondere in lebenden Zellen mit solchen klassischen Verfahren. 
Förster Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein Verfahren zur Erkennung von Proteinaggregation und Strukturwandel. FRET ist jedoch nicht in der Lage, die Proteindynamik zu analysieren (z. B. Diffusion und Oligomerisierung von Proteinen in lebenden Zellen)3. Daher führen wir hier ein einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinaggregation in Lösung (z.B. Zelllysat) und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ein, das die Diffusionseigenschaft und Helligkeit fluoreszierender Moleküle mit einzelmolekularer Empfindlichkeit4misst. FCS ist eine Photonenzählmethode mit einem Laserscan-Konfokalmikroskop (LSM). Mit Hilfe eines hochempfindlichen Photonendetektors und der Berechnung der Autokorrelationsfunktion (ACF) der Photonenankunftszeit wird der Durchlauf von Zeit und Helligkeit der Fluoreszenzmoleküle im Nachweisvolumen gemessen. Die Diffusion verlangsamt sich mit einer Erhöhung des Molekulargewichts; daher kann die intermolekulare Interaktion mit FCS geschätzt werden. Noch stärker ist, dass eine Erhöhung der Helligkeit des fluoreszierenden Moleküls auf eine Homo-Oligomerisierung der Moleküle hindeutet. Daher ist FCS ein leistungsfähiges Werkzeug, um eine solche Proteinaggregation zu erkennen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS), Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit (HD) und so weiter. Zur Detektion und Analyse von löslichen oder diffusen Proteinoligomeren oder Aggregaten wurde die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet, die die Diffusionsgeschwindigkeit und Helligkeit eines einzelnen Teilchens mit einer einzigen Molekülempfindlichkeit erkennen kann. Das richtige Verfahren und Know-how für den Nachweis der Proteinaggregation wurde jedoch nicht weit verbreitet. Hier zeigen wir ein Standardverfahren der FCS-Messung für Diffusionseigenschaften von aggregationsanfälligen Proteinen in Zelllysat- und Lebendzellen: ALS-assoziiertes 25 kDa-Carboxyl-Terminalfragment des TAR-DNA/RNA-bindenden Proteins 43 kDa (TDP25) und der Superoxiddismutase 1 (SOD1). Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass ein Teil der Aggregate von grünem fluoreszierendem Protein (GFP)-getaggt TDP25 leicht in den löslichen Anteil des murinen Neuroblastoms Neuro2a-Zelllysat einbezogen wurde. Darüber hinaus zeigt GFP-markierte SOD1-Mutation, die ALS-assoziierte Mutation trägt, eine langsamere Diffusion in lebenden Zellen. Dementsprechend führen wir hier das Verfahren ein, um die Proteinaggregation über ihre Diffusionseigenschaft mit FCS zu erkennen.

Wir führten die FCS-Messung von GFP-TDP25 in Zelllysat und SOD1-G85R-GFP in lebenden Zellen durch. In beiden Fällen konnten eine positive Amplitude und glatte ACFs erworben werden. Wir haben gezeigt, dass ein Teil von GFP-TDP25, ausgedrückt in Neuro2a-Zellen, in der löslichen Fraktion unter der angegebenen Bedingung6zurückgewonnen wurde. Im löslichen Anteil des Zelllysats wurden extrem helle Fluoreszenzmoleküle im Photonenzählratenrekord mit FCS nachgewiesen(Abbildung ...

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Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Das beste Prinzip der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, FCS, wurde ursprünglich in den 1970er Jahren erfunden. In den 1990er Jahren wurden wichtige und viele Verbesserungen für FCS durch die Kombination mit einer konfokalen Apparatmikroskopie etabliert. Seitdem wird FCS für viele chemische und Virusheilanwendungen eingesetzt, wie z. B. molekulare Wechselwirkungen und Proteinaggregationsanalysen.Die Proteinaggregation ist ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen. Fluoreszenzhelligkeit sind einzelne Partikel in Aktion molekularer Größen, die durch Diffusionseigenschaften erklärt werden. Es ist sehr wichtig bei der Messung von Proteinaggregationen, weil es projizierte Lebenszyklen von Molekülen bestimmen kann, aber auch die Homo- oder Heteropolymerisation unterscheiden kann.Hier führen wir ein Verfahren zur Messung der Diffusion von amyotropher Lateralsklerose im Zusammenhang mit aggregiertem Formprotein mit FCS in Zelllysaten und lebenden Zellen ein. Bereiten Sie 100 Millimeter Kunststoffschale wachsen Neuro2a Zelle bequem sitzend im normalen Wachstumsmedium. Bestätigen Sie die Zellkonfluenk.Entfernen Sie das Medium. Fügen Sie 3,5 Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung in die dritte Patronenschale und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für eine Minute. Fügen Sie 9,5 Milliliter normales Wachstumsmedium in die Schale und suspendieren Sie sie.Die Zellsuspension wird mit Trypanblau gemischt, um die abgestorbenen Zellen zu färben. Fügen Sie der Zellzählfolie eine Suspension hinzu. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Zellenzähler verwenden, oder manuell.Überprüfen Sie die Live-Zellennummer und ihre Lebensfähigkeit. Verdünnen Sie die Zelle im gezählten Medium mit 1,0 mal 10 auf die Leistung von 5 pro Milliliter. Fügen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in die 35-Millimeter-Kunststoffschale für Zelllyse oder Wachstumsraumschale für die Live-Zellmessung ein.Bebrüte das Gericht bei 37 Grad Celsius für einen Tag. Am nächsten Tag die Mischung aus Plasmid-DNA und den Transfektionsreagenzien zubereiten. Fügen Sie die Transfektionsmischung dem zellgezählten Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.Einen Tag später. Überprüfen Sie die GFP-Expression mit einem Routinemikroskop. Sie können die sehr hellen TDP25 Zutat Körper in Zellen zu sehen.Die Zelllyse sollte an der biochemischen Bank durchgeführt werden. Entfernen Sie das Medium in der Schale. Fügen Sie zwei Milliliter PBS bei 25 Grad Celsius als Medium zu waschen.Entfernen Sie die PBS. Legen Sie die Schale auf eine Aluminiumplatte auf der Oberseite des zerkleinerten Eises. Sofort den 200 Mikroliter-Lysepuffer in die Schale geben.Scrape die Schale mit einem Zellschaber. Das Lysat mit ungelöstem Zellmüll in einem neuen 1,5-Millimeter-Rohr wiederherstellen. Zentrifugieren Sie das Lysat bei vier Grad Celsius.Ersetzen Sie bei Live-Zellmessungen das Medium vor der Messung durch ein frisches Medium. Überprüfen Sie die Zellbefestigung mit einem Phasenkontrastmikroskop. Überprüfen Sie auch die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzmikroskop.Verwenden Sie ein konfokales, mit Mikroskop kombiniertes FCS-System. Schalten Sie den 488-Nanometer-Laser ein. Stabilisieren Sie das System mindestens 30 Minuten lang.Richten Sie den optischen Pfad ein. Verwenden Sie einen 488 Nanometer Laser für das sofortige Licht. Verwenden Sie einen geeigneten Strahlsplitter und dichroitische Zähler.Und auch Fluoreszenz-Fuser. Normalerweise verwenden wir Deckglaskammern für Kalibrierungen und Lösungsmessungen. Nehmen Sie vorsichtig die AbdeckungGlaskammer.Legen Sie die Glasoberfläche auf das Linsensiebpapier. Gießen Sie die FCS-Kalibrierung. Fügen Sie auch die Rhodamine 6G Lösung hinzu.Fügen Sie das reines Wasser auf das Ziel. Verwenden Sie das Öl nicht. Stellen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe.Verschieben Sie die Bühne an die entsprechende Position. Erstellen Sie die Lochanpassung und öffnen Sie den Lochanpassungsassistenten. Überwachen Sie die Photonenanzahl als grobe Bewegung des Lochs für die x-Richtung.Die hellste Position wurde zu Recht bestimmt. Überwachen Sie als Nächstes die Photonenanzahl als feine Bewegung. Die hellste Position wurde erfolgreich ermittelt Dies ist die Lochposition für x-Richtung.Suchen Sie auf die gleiche Weise die hellste Position des Lochs nach y-Richtung. Die hellste Position für y-Richtung wurde ebenfalls erfolgreich ermittelt. Die x- und y-Position des Lochs verdichten.Es ist besser, die Lochposition vor der Messung eines jeden Tages einzustellen. Wenn der Live-Pfad geändert wird, muss die Lochposition erneut angepasst werden. Erstellen Sie eine Zählrate und überwachen Sie die Telefonanzahl.Wechseln Sie in den CPM-Überwachungsmodus. Zählen Sie den Korrekturring des ausgeführten Objekts, sodass der CPM-Wert der höchste ist. Schließen Sie das Fenster mit der Zählrate.Beginnen Sie mit der Rhodamine 6G Lösungsmessung. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Anpassung, um die Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen. Wählen Sie ein Modell zum Anpassen der alten Korrelationsfunktion aus.Wählen Sie für Rhodamine 6G das Modell für die 1-Komponenten-, 3-dimensionale Diffusion mit einem Triplet-Zustand aus. Legen Sie die passende Startzeit fest, indem Sie die rote Linie verschieben. Klicken Sie auf Alle anpassen, um die Anpassungsberechnung zu starten.Überprüfen Sie die Anpassungsabweichung. Stellen Sie sicher, dass die Seiten gebucht und negativ sind, um Null. Überprüfen Sie die angepassten Werte.Stellen Sie sicher, dass die Diffusionszeit ungefähr im Bereich von 20-30 Mikrosekunden liegt. Darüber hinaus sind die strukturellen Parameter von vier bis acht. Öffnen Sie das Anpassungspanel, und wählen Sie ein Modell für die Messung aus.Geben Sie denselben strukturellen Parameterwert in das Modell für das Beispiel im Anpassungsbereich ein. Stellen Sie sicher, dass der Typ als "Fest" festgelegt werden soll. GFP-TDP25-Messung im Zelllysat.Legen Sie das Lysat in die Deckglaskammer. Legen Sie den Deckel, um das Austrocknen des Lysats zu vermeiden. Stellen Sie den Bühnendeckel für die leichte Schattierung auf.Legen Sie im Erfassungspanel die Laserleistung, die Messzeit und ihre Wiederholungen fest. Starten Sie die Erfassung. Es wurde eine Spitze beobachtet.Erneut wurde eine Spitze beobachtet. Die Spitze zeigt helle Moleküle an, die durch den Nachweiskörper geleitet werden. Spikes zeigen lösliche Oligomere oder Aggregate an.Erstellen Sie eine Anpassung, um eine Kurvenanpassungsanalyse durchzuführen. Wählen Sie das Modell für die 2-Komponenten- 3-dimensionale Diffusion mit Triplet-Zustand aus. Legen Sie die Anfangszeit des Fittings fest.Klicken Sie auf "Alle anpassen". Überprüfen Sie die angepassten Werte. SOD1-G85R mit GFP-Messung in einer Lebenden Zelle markiert.Im Gegensatz zur Lösungsmessung empfehle ich die Verwendung des Wärmestufen-Inkubators. Stellen Sie die zellkultivierende Schale auf die Mikroskopstufe. Bestätigen Sie den Fokus und die Position mit dem Okular.Wählen Sie eine Messzelle aus. Zoomen Sie ein und passen Sie die Zellenposition mithilfe eines schnellen Scanmodus an. Erfassen Sie den Snapshot der Zellen mithilfe des langsamen Scangeschwindigkeitsmodus.Wählen Sie mit dem Positionswerkzeug eine FCS-Messposition aus. Das Fadenkreuz zeigt die Messposition an. Starten Sie die Messung.Der leichte Rückgang der Photonenzählung deutet auf photobleaching von GFP hin. Führen Sie die Kurvenanpassung aus. Repräsentative Ergebnisse von GFP-TDP25 in Zelllysat werden gezeigt.Das obere Diagramm zeigt die Photonenanzahl auf. Wo es Pfeile gibt, ist eine Spitze, die auf lösliche Oligomere und Aggregate hindeutet. Das mittlere Diagramm stellt die alte Korrelationsfunktion dar.Die graue Linie zeigt die niedrige, alte Korrelationsfunktion. Die Magenta-Linie zeigt die angepasste Funktion an. Die gepunkteten Linien geben die Anfangs- und Endzeiten für die Anpassung an.Die untere Tabelle zeigt den angepassten Wert. Als nächstes werden repräsentative Ergebnisse von SOD1-G85R-GFP in einer Livezelle gezeigt. Das obere Diagramm stellt einen Datensatz unserer Photonenanzahl dar.Der allmähliche Rückgang der aufgezeichneten Photonenzahl wurde beobachtet, was auf photobleichendes GFP-Wachstum für verschiedene Messungen hindeutet. Dies ist aufgrund der langsamen Diffusionsgeschwindigkeit in lebenden Zellen. Das mittlere Diagramm stellt die alte Korrelationsfunktion von SOD1 dar.Die graue Linie zeigt die niedrige, alte Korrelationsfunktion. Die Magenta-Linie zeigt die angepasste Funktion. Die gepunkteten Linien geben die Anfangs- und Endzeiten mit Fitting an.Die untere Tabelle zeigt angepasste Werte. Hier zeigen wir Ihnen dieses Verfahren zur Messung der Diffusion aus jeder Zell assoziierten TDP-25 in Zelllysat und alles Mutant von SOD1 in lebenden Zellen mit FCS. Die löslichen Oligomere und die Aggregation im Zelllysat können oft als Spitzen oder Ausbrüche beobachtet werden.Andererseits werden solche Spitzen in lebenden Zellen selten beobachtet, mit Ausnahme möglicherweise offensichtlicher Lebendstrukturen. Eine langsam diffundierende Art von mutierten SOD1 fügt mittlere Helligkeit für einzelne Partikel wie SOD1 Homopolymerisation im Inneren für uns hinzu. Das hier gezeigte Verfahren ist einfach und lohnend.FCS enthält keine Strahlung;direkt ruhender Zustand. Es ist nur Ihre und unsere Vorstellungskraft Empathie.

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Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detektion von Protein-Wechselwirkungen in Plant mit einem Gateway kompatibel bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...