Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

A.K. נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק בסיוע למחקר מדעי (C) (#18K06201), על ידי מענק בסיוע של קרן Nakatani לאופני נגד זיהומים חדשים בנגיף הקורונה, על ידי מענק ממשרד אוניברסיטת הוקאידו לפיתוח מנהיגי מחקר עתידיים (L-Station), ומענק בסיוע מקרן Hoansha. M. K. נתמך חלקית על ידי JSPS Grant-in-Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים "כימיה עבור מערכות ביולוגיות צפיפות רב-מולקולריות" (#20H04686), ומענק JSPS למחקר מדעי על תחומים חדשניים "פיזיקת מידע בענייני חיים" (#20H05522).

1. חומרים ריאגנטים
<ol><li>השתמש בפתרונות חינם pyrogenic ובינוני עבור תרבות התא (טבלה 1).</li>
	<li>הכינו פתרונות לניסוי הביוכימי באמצעות מים אולטרה-דקים והשתמשו בהם כ-DNase/RNase ללא תשלום.</li>
	<li>בחר FBS מתאים עבור תרבות התא עם תהליך בדיקה רב. מאחר שמגרש FBS שנבחר משתנה באופן קבוע, אין אפשרות לייצג כאן ...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

לגבי כיול המערכת לפני המדידות, יש להשתמש באותן כלי זכוכית המשמשים למדידת הדגימה (למשל, 8 הבארות מכסות תא זכוכית עבור ליזלת תאים ותבשיל בסיס זכוכית 35 מ"מ לתאים חיים). בגלל ספיחה של Rh6G על הזכוכית, הריכוז האפקטיבי שלה עשוי לפעמים להקטין. אם כן, יש להשתמש בתמיסת Rh6G מרוכזת מאוד כגון μM 1 רק להתאמת חו...

צבירות חלבון המערבות הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, וכן הלאה1 ידועים להיות רעילים יפריע הומאוסטזיס חלבון (פרוטוסטזיס) בתאים ובאיברים, זה יכול אז להוביל להזדקנות2. אישור צבירת החלבון צפוי כאסטרטגיה טיפולית; עם זאת, כימיקלים המונעים היווצרות צבירת חלבונים ואגרגטים של חלבונים משפילים (למשל, מולקולות קטנות או תרופות) עדיין לא הוקמו. יתר על כן, איך צבירת חלבון מפעיל רעילות נשאר חמקמק. לכן, כדי לקדם פרויקטים מחקריים הקשורים לצבירת חלבונים, חשוב להציג נהלי תפוקה גבוהים פשוט כדי לזהות צבירת חלבונים. גילוי צבירת חלבונים באמצעות נוגדנים המזהים את ההתאמה של צבירת חלבונים וצבירה ספציפית לצבירה צבע פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב3. עם זאת, קשה לזהות את הצבירה, במיוחד בתאים חיים באמצעות הליכים קלאסיים כאלה. 
העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא הליך לגילוי צבירת חלבונים ושינוי מבני. עם זאת, FRET אינו מסוגל לנתח את דינמיקת החלבון (למשל, דיפוזיה ואוליגומריזציה של חלבון בתאים חיים)3. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט לזיהוי צבירת חלבונים בתמיסה (למשל, ליזלת תאים) ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות (FCS), המודדת את מאפיין הדיפוזיה והבהירות של מולקולות פלואורסצנטיות עם רגישות למולקולותבודדות 4. FCS היא שיטת ספירת פוטון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר (LSM). באמצעות גלאי פוטון רגיש מאוד וחישוב של פונקציית התיקון האוטומטי (ACF) של זמן ההגעה של פוטון, המעבר בזמן ובבהירות של מולקולות הפלואורסצנט בנפח הגילוי נמדד. הדיפוזיה מאטה עם עלייה במשקל מולקולרי; לכן, אינטראקציה בין מולקולרית ניתן להעריך באמצעות FCS. אפילו יותר בעוצמה, עלייה בבהירות של מולקולת הפלואורסצנט מצביעה על הומו-אוליגומריזציה של המולקולות. לכן, FCS הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות צבירת חלבון כזה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS), מחלת אלצהיימר (לספירה), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), וכן הלאה. כדי לזהות ולנתח אוליגומרים או אגרגטים של חלבונים מסיסים או מפוזרים, נעשה שימוש בספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS), שיכולה לזהות את מהירות הדיפוזיה והבהירות של חלקיק יחיד עם רגישות למולקולות בודדות. עם זאת, ההליך הנכון והידע לגילוי צבירת חלבונים לא שותפו באופן נרחב. כאן, אנו מראים הליך סטנדרטי של מדידת FCS עבור מאפייני דיפוזיה של חלבונים נוטים לצבירה בתאים ליזאטים חיים: ALS הקשורים 25 kDa קרבוקסיל-מסוף שבר של TAR DNA / RNA מחייב חלבון 43 kDa (TDP25) ו סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). התוצאות הייצוגיות מראות כי חלק אגרגטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מתויג TDP25 נכלל מעט בחלק מסיס של neuroblastoma מורין Neuro2a תא lysate. יתר על כן, GFP מתויג SOD1 נושאת מוטציה הקשורה ALS מראה דיפוזיה איטית יותר בתאים חיים. בהתאם לכך, אנו מציגים כאן את ההליך לגילוי צבירת החלבון באמצעות נכס הדיפוזיה שלו באמצעות FCS.

ביצענו מדידת FCS של GFP-TDP25 בתא ליסקאט ו- SOD1-G85R-GFP בתאים חיים. בשני המקרים, משרעת חיובית ACFs חלקה הצליחו לרכוש. הראינו כי חלק GFP-TDP25 לידי ביטוי בתאי Neuro2a התאושש בשבר מסיס תחת התנאי המצוין6. בחלק המסיס של lysate התא, מולקולות פלואורסצנטיות בהירות מאוד זוהו ברשומה קצב ספירת פוטון באמצעות FCS (<...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

העיקרון הטוב ביותר של ספקטרוסקופיית מתאם הפלואורסצנטיות, FCS, הומצא לראשונה בשנות השבעים. בשנות התשעים, שיפורים חשובים ורבים עבור FCS הוקמה על ידי שילוב עם מיקרוסקופיה של מנגנון confocal. מאז, FCS שימש עבור יישומים רבים ריפוי כימיים ווירוסים, כגון אינטראקציות מולקולריות וניתוח צבירת חלבון.צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות. בהירות פלואורסצנטיות הם חלקיקים בודדים בפעולה בגדלים מולקולריים המוסברים על ידי תכונות דיפוזיה. זה מאוד חשוב במדידת צבירות חלבון כי זה יכול לקבוע מחזורי חיים מוקרנים של מולקולות, אלא גם להבחין בין הומו או פולמריזציה הטרו.כאן, אנו מציגים הליך למדידת דיפוזיה של טרשת לרוחב amyotrophic הקשורים חלבון טופס מצטבר באמצעות FCS ב lysates התא ותאים חיים. הכן צלחת פלסטיק 100 מילימטר גדל Neuro2a תא יושב בנוחות במדיום הצמיחה הרגילה. אשר את מפגש התאים.הסר את המדיום. מוסיפים 3.5 מיליליטר של תמיסת טריפסין-אדטה לצלחת המחסנית השלישית ומדגירים אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. מוסיפים 9.5 מיליליטר בינוני צמיחה נורמלי לתוך המנה להשעות אותם.השעיית התא מעורבבת עם כחול טריפאן כדי להכתים את התאים המתים. הוסף השעיה לשקופית ספירת התאים. ספור את מספר התאים המשתמשים במונה התאים, או באופן ידני.בדוק את מספר התא החי ואת הכדאיות שלהם. לדלל את התא במדיום שנספר ב 1.0 פעמים 10 לעוצמה של 5 למיליליטר. הוסף שני מיליליטרים של השעיית תאים לתוך צלחת פלסטיק 35 מילימטר עבור תמוגה תא או צלחת שטח צמיחה למדידת תא חי.דגירה את המנה ב 37 מעלות צלזיוס ליום אחד. למחרת, להכין את התערובת של DNA פלסמיד ואת reagents transfection. מוסיפים את תערובת ההעתקה למדיום הנספר בתאים ומדגירה את התאים במשך 24 שעות.יום אחד לאחר מכן. בדוק את ביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ שגרתי. אתה יכול לראות את גופי המרכיב TDP25 בהיר מאוד בתאים.תמוגה של תאים צריכה להתבצע בספסל הביוכימי. מוציאים את המדיום בצלחת. מוסיפים שני מיליליטר של PBS ב 25 מעלות צלזיוס לשטוף כמדיום.הסר את PBS. מניחים את המנה על צלחת אלומיניום על החלק העליון של הקרח כתוש. מיד, מוסיפים את חיץ תמוגה 200 microliter לתוך המנה.מגרדים את המנה באמצעות מגרד תאים. לשחזר את lysate עם פסולת תא לא פתורה בצינור חדש 1.5 מילימטר. צנטריפוגה lysate בארבע מעלות צלזיוס.למדידות תאים חיים, החליפו את המדיום במדידה טרייה לפני המדידה. בדוק את הקובץ המצורף לתא באמצעות מיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה. כמו כן, בדוק את הביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.השתמש במערכת FCS משולבת מיקרוסקופ קונפוקלית. הפעל את לייזר 488 ננומטר. לייצב את המערכת, לפחות, במשך 30 דקות.הגדר את הנתיב האופטי. השתמש לייזר 488 ננומטר עבור האור המיידי. השתמש מפצל קרן מתאים מטרים dichroic.וגם, נתיכים פלואורסצנטיים. בדרך כלל, נשתמש בתאי כיסוי לכיול ומדידות פתרון. בזהירות, קח את תא הכיסוי.מניחים את משטח הזכוכית על נייר ההקרנה של העדשה. יוצקים את כיול FCS. הוסף את פתרון רודמין 6G גם כן.מוסיפים את המים האולטרה-דקים על המטרה. אין להשתמש בשמן. שים את התא על במת המיקרוסקופ.הזז את הבמה למיקום המתאים. צרו את התאמת חור הסיכה ופתחו את אשף התאמת חור הסיכה. נטר את קצב ספירת הפוטונין כתנועה גסה של חור הסיכה עבור כיוון ה- x.התנוחה הבהירה ביותר נקבעה בצדק. לאחר מכן, נטר את קצב ספירת הפוטונין כתנועה עדינה. המיקום הבהיר ביותר נקבע בהצלחה זהו מיקום חור הסיכה עבור x-כיוון.באותו אופן, לחפש את המיקום הבהיר ביותר של חור סיכה עבור y-כיוון. המיקום הבהיר ביותר עבור y-כיוון נקבע גם בהצלחה. מורכבות x ו y המיקום של חור סיכה.עדיף להתאים את מיקום חור הסיכה לפני המדידה של כל יום. כאשר הנתיב החי משתנה, יש להתאים שוב את מיקום חור הסיכה. צור קצב ספירה ונטר את קצב ספירת הטלפונים.עבור למצב הניטור של עלות לאלף חשיפות. ספור את טבעת התיקון של האובייקט שהרצת כך שערך עלות לאלף חשיפות הוא הגבוה ביותר. סגור את חלון שער הספירה.התחל עם מדידת פתרון רודמין 6G. לאחר השלמת המדידה, לחץ על ההתאמה כדי לבצע ניתוח התאמת עקומה. בחר מודל להתאמת פונקציית המתאם הישנה.עבור רודמין 6G, בחר את המודל עבור 1-רכיב, פיזור תלת מימדי עם מצב שלישייה. הגדר את שעת ההתחלה המתאימה על-ידי הזזת הקו האדום. לחץ על התאם הכל, כדי להתחיל בחישוב ההתאמה.בדוק את סטיית ההתאמה. ודא כי הצדדים מתפרסמים ושליליים, סביב אפס. בדוק את הערכים המותאמים.ודא שזמן הדיפוזיה הוא בערך בטווח של 20-30 מיקרו-שניות. יתר על כן, הפרמטר המבני הוא מארבע עד שמונה. פתחו את החלונית fit ובחרו דגם למדידה.הזינו את אותו ערך פרמטר מבני בדגם לדגימה בחלונית 'התאמה'. ודא שיש להגדיר את הסוג כקבוע. מדידת GFP-TDP25 ב-lysate התא.מניחים את הליסט בתא הכיסוי. מניחים את המכסה כדי למנוע ייבוש של lysate. מניחים את מכסה הבמה להצללה קלה.בלוח הרכישה, הגדר את עוצמת הלייזר, את זמן המדידה ואת החזרות שלו. התחל את הרכישה. יתד נצפתה.ספייק נצפה שוב. היתד מצביע על מולקולות בהירות שעברו בגוף הגילוי. קוצים מצביעים על אוליגומרים או אגרגטים מסיסים.צור התאמה לביצוע ניתוח התאמת עקומה. בחר את המודל עבור דיפוזיה תלת-ממדית דו-רכיבית עם מצב שלישייה. הגדר את שעת ההתחלה המתאימה.לחץ על התאם הכל. בדוק את הערכים המותאמים. SOD1-G85R מתויג במדידת GFP בתא חי.שלא כמו מדידת פתרון, אני ממליץ להשתמש באינקובטור שלב החום. הניחו את צלחת פולחן התאים על במת המיקרוסקופ. אשר את המוקד ואת המיקום באמצעות העין.בחר תא מדידה. הגדלה והתאמת מיקום התא באמצעות מצב סריקה מהיר. השג את תמונת התמונה של התאים באמצעות מצב מהירות הסריקה האיטית.בחרו מיקום למדידת FCS בעזרת הכלי מיקום. הכוונת מציינת את מיקום המדידה. התחל את המדידה.הירידה הקלה של רשומת קצב ספירת הפוטונין מרמזת על פוטובלצ'ינג של GFP. בצע את התאמת העקומה. מוצגות תוצאות מייצגות של GFP-TDP25 ב- lysate של התא.הגרף העליון רישום של שיעור ספירת פוטון. איפה שיש חצים הוא ספייק, מציע אוליגומרים מסיסים ואגרגטים. הגרף האמצעי מייצג את פונקציית המתאם הישנה.הקו האפור מציג את פונקציית המתאם הנמוכה והוותיקת. קו המגנטה מציג את הפונקציה המותאמת. הקווים המנוקדים מציינים את שעות ההתחלה והסיום להתאמה.הטבלה התחתונה מציגה את הערך המותאם. לאחר מכן, מוצגות תוצאות מייצגות של SOD1-G85R-GFP בתא חי. הגרף העליון מייצג תיעוד של שיעור ספירת הפוטונין שלנו.הירידה ההדרגתית של שיעור ספירת הפוטונין המתועד נצפתה, מה שמרמז על פוטובלאצ'ינג של צמיחת GFP למדידות שונות. הסיבה לכך היא מהירות הדיפוזיה האיטית בתאים חיים. הגרף האמצעי מייצג את פונקציית המתאם הישנה של SOD1.הקו האפור מציג את פונקציית המתאם הנמוכה והוותיקת. קו המגנטה מציג את הפונקציה המותאמת. הקווים המנוקדים מציינים את שעות ההתחלה והסיום בהתאמה.הטבלה התחתונה מציגה ערכים מותאמים. כאן אנו מראים לך הליך זה כדי למדוד דיפוזיה מכל תא המשויך TDP-25 ב lysate התא וכל מוטציה של SOD1 בתאים חיים באמצעות FCS. אוליגומרים מסיסים וצבירה ב lysate התא ניתן לראות לעתים קרובות כמו קוצים או התפרצויות.מצד שני, בתאים חיים, קוצים כאלה נצפו לעתים רחוקות, למעט מבנים חיים ברורים. מינים מתפזרים לאט של מוטציה SOD1 של להוסיף בהירות ממוצעת עבור חלקיקים בודדים כגון הומופולימריזציה SOD1 בפנים עבורנו. ההליך המוצג כאן הוא פשוט וכדאי.FCS אינו מכיל קרינה;מצב רדום ישירות. זו רק האמפתיה הדמיון שלך ושלנו.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

זיהוי של חלבון Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...