Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
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एके को जापान सोसायटी फॉर प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) (#18K06201) द्वारा नॉवल कोरोनावायरस संक्रमणों के खिलाफ प्रतिकार के लिए नाकातानी फाउंडेशन से अनुदान-सहायता द्वारा, होक्काइडो विश्वविद्यालय कार्यालय से भविष्य के अनुसंधान नेताओं (एल-स्टेशन) के विकास के लिए अनुदान और होनशा फाउंडेशन से अनुदान-सहायता द्वारा समर्थित किया गया था । एम के आंशिक रूप से अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक JSPS अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था "बहुमॉलिक्यूलर क्राउडिंग बायोसिस्टम्स के लिए रसायन विज्ञान" (#20H04686), और एक जेएसएसपीएस ग्रांट-इन-एड अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए "जीवित मामलों की सूचना भौतिकी" (#20H05522) ।

1. सामग्री और अभिकर् ता
<ol><li>सेल कल्चर(टेबल 1)के लिए पायरोजेनिक फ्री सॉल्यूशंस और मीडियम का इस्तेमाल करें।</li>
	<li>अल्ट्रापुरे पानी का उपयोग करके जैव रासायनिक प्रयोग के लिए समाधान तैयार करें और DNase/RNase मु...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

माप से पहले सिस्टम अंशांकन के बारे में, नमूना मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान कांच के सामान का उपयोग किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 8-कुएं सेल लिस्लेट के लिए ग्लास चैंबर और जीवित कोशिकाओं के लिए 35-मि?...

एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, हंटिंगटन रोग जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों से जुड़े प्रोटीन एकत्रीकरण, और इतने पर 1 विषाक्त होने के लिए जानाजाता है और कोशिकाओं और अंगों में प्रोटीन होमोस्टेसिस (प्रोटेओस्टेसिस) को परेशान करेगा, जो तब उम्र बढ़ने का कारणबनसकता है। प्रोटीन एकत्रीकरण की मंजूरी एक चिकित्सीय रणनीति के रूप में अपेक्षित है; हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण गठन को रोकने और प्रोटीन समुच्चय (जैसे, छोटे अणुओं या दवाओं) को नीचा दिखाने वाले रसायन अभी तक स्थापित नहीं किए गए हैं। इसके अलावा, प्रोटीन एकत्रीकरण विषाक्तता को कैसे लागू करता है, मायावी रहता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण से संबंधित अनुसंधान परियोजनाओं को बढ़ावा देने के लिए, प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए उच्च थ्रूपुट प्रक्रियाएं शुरू करना महत्वपूर्ण है। प्रोटीन एकत्रीकरण और एकत्रीकरण-विशिष्ट फ्लोरोसेंट डाई की संरचना को पहचानने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है3। हालांकि, एकत्रीकरण का पता लगाना मुश्किल है, खासकर ऐसी शास्त्रीय प्रक्रियाओं का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में। 
Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) प्रोटीन एकत्रीकरण और संरचनात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया है। हालांकि, FRET प्रोटीन गतिशीलता (जैसे, प्रसार और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन के अल्पाधिकार) का विश्लेषण करने में असमर्थ है3. इसलिए, हम यहां एक सरल प्रोटोकॉल पेश करते हैं ताकि फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) का उपयोग करके समाधान (जैसे, सेल लिसेट) और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाया जा सके, जो एकल अणु संवेदनशीलता4के साथ फ्लोरोसेंट अणुओं की प्रसार संपत्ति और चमक को मापता है। एफसीएस लेजर स्कैन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (एलएसएम) का उपयोग करके एक फोटॉन-काउंटिंग विधि है। फोटॉन आगमन समय के एक अत्यधिक संवेदनशील फोटॉन-डिटेक्टर और ऑटोकोरिएलेशन फ़ंक्शन (एसीएफ) की गणना का उपयोग करके, पता लगाने की मात्रा में फ्लोरोसेंट अणुओं के समय और चमक के माध्यम से गुजरता है। प्रसार आणविक वजन की वृद्धि के साथ धीमा हो जाता है; इस प्रकार, एफसीएस का उपयोग करके इंटरमॉलिकुलर इंटरैक्शन का अनुमान लगाया जा सकता है। इससे भी अधिक शक्तिशाली रूप से, फ्लोरोसेंट अणु की चमक में वृद्धि अणुओं के होमो-ओलिगोमेराइजेशन को इंगित करती है। इसलिए, एफसीएस इस तरह के प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

प्रोटीन एकत्रीकरण न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), अल्जाइमर रोग (एडी), पार्किंसंस रोग (पीडी), हंटिंगटन रोग (एचडी) आदि की एक बानगी है। घुलनशील या फैलाना प्रोटीन ओलिगोमर या समुच्चय का पता लगाने और विश्लेषण करने के लिए, फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस), जो एक ही अणु संवेदनशीलता के साथ एक कण की प्रसार गति और चमक का पता लगा सकता है, का उपयोग किया गया है। हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने के लिए उचित प्रक्रिया और जानकारी व्यापक रूप से साझा नहीं किया गया है । यहां, हम सेल लिसेट और लाइव कोशिकाओं में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन के प्रसार गुणों के लिए एफसीएस माप की एक मानक प्रक्रिया दिखाते हैं: एएलएस-संबद्ध 25 केडीए कार्बोक्सिल-टार डीएनए/आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन 43 केडीए (टीडीपी 25) और सुपरऑक्साइड डिस्ट्यूट 1 (एसओडी) का टर्मिनल टुकड़ा। प्रतिनिधि परिणाम बताते हैं कि हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) टैग किए गए टीडीपी25 के समुच्चय का एक हिस्सा थोड़ा मुरीन न्यूरोब्लास्टोमा न्यूरो2ए सेल lysate के घुलनशील अंश में शामिल किया गया था। इसके अलावा, GFP टैग SOD1 ALS से जुड़े उत्परिवर्तन ले जाने के लाइव कोशिकाओं में एक धीमी प्रसार से पता चलता है । तदनुसार, हम यहां एफसीएस का उपयोग करके अपने प्रसार संपत्ति के माध्यम से प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाने की प्रक्रिया शुरू करते हैं।

हमने लाइव सेल में सेल लिसेट और एसओडी1-जी85आर-जीएफपी में जीएफपी-टीडीपी25 का एफसीएस माप किया। दोनों ही मामलों में, एक सकारात्मक आयाम और चिकनी ACFs का अधिग्रहण करने में सक्षम थे । हमने दिखाया है कि न्यूरो2ए कोशि?...

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Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

हम यहां फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके कोशिका ओं और जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन ओलिगोमर और एकत्रीकरण को मापने के लिए एक प्रक्रिया शुरू करते हैं।

फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन एकत्रीकरण का पता लगाना

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

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