Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
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A.K. è stato sostenuto da una sovvenzione della Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), da una sovvenzione della Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, da una sovvenzione dell'Ufficio universitario di Hokkaido per lo sviluppo dei futuri leader della ricerca (L-Station) e da una sovvenzione della Hoansha Foundation. M. K. è stato parzialmente supportato da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Chimica per biosistemi multimolecolari di affollamento" (#20H04686) e da una sovvenzione JSPS per la ricerca scientifica su aree innovative "Fisica dell'informazione delle questioni viventi" (#20H05522).

1. Materiali e reagenti
<ol><li>Utilizzare soluzioni e mezzi pirogenici liberi per la coltura cellulare(tabella 1).</li>
	<li>Preparare soluzioni per l'esperimento biochimico utilizzando acqua ultrapura e utilizzare come privo di DNasi/RNasi.</li>
	<li>Selezionare un FBS appropriato per le impostazioni cultura delle celle con un processo di controllo del lotto. Poiché il lotto FBS selezionato cambia regolarmente, il catalogo e il numero di lotto per FBS non possono essere rappresentati qui.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

Per quanto riguarda la taratura del sistema prima delle misurazioni, devono essere utilizzate le stesse vetrerie utilizzate per misurare il campione (ad esempio, la camera di vetro di copertura a 8 pozzi per il lisato cellulare e la base in vetro da 35 mm per celle vive). A causa dell'adsorbimento di Rh6G sul vetro, la sua concentrazione effettiva può talvolta diminuire. In tal caso, una soluzione Rh6G altamente concentrata come 1 μM deve essere utilizzata solo per la regolazione del foro stenopeica. Le velocità di co...

Le aggregazioni proteiche che coinvolgono disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, il morbo di Huntington ecosì via sono note per essere tossiche e disturberebbero l'omeostasi proteica (proteostasi) nelle cellule e negli organi, che potrebbe quindi portare all'invecchiamento2. La clearance dell'aggregazione proteica è prevista come strategia terapeutica; tuttavia, non sono ancora state stabilite sostanze chimiche che impediscono la formazione di aggregazione proteica e degradano aggregati proteici (ad esempio, piccole molecole o farmaci). Inoltre, il modo in cui l'aggregazione proteica esercita la tossicità rimane inafferrabile. Pertanto, per promuovere progetti di ricerca relativi all'aggregazione proteica, è importante introdurre procedure ad alta produttività per rilevare semplicemente l'aggregazione proteica. Il rilevamento dell'aggregazione proteica utilizzando anticorpi che riconoscono la conformazione dell'aggregazione proteica e del colorante fluorescente specifico dell'aggregazione è statoampiamente utilizzato 3. Tuttavia, è difficile rilevare l'aggregazione, specialmente nelle cellule vive che utilizzano tali procedure classiche. 
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è una procedura per rilevare l'aggregazione proteica e il cambiamento strutturale. Tuttavia, fret non è in grado di analizzare la dinamica proteica (ad esempio, diffusione e oligomerizzazione delle proteine nelle cellule vive)3. Pertanto, introduciamo qui un semplice protocollo per rilevare l'aggregazione proteica in soluzione (ad esempio, lisato cellulare) e cellule vive utilizzando spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), che misura la proprietà di diffusione e la luminosità delle molecole fluorescenti con sensibilità a singolamolecola 4. FCS è un metodo di conteggio dei fotoni utilizzando un microscopio confocale a scansione laser (LSM). Utilizzando un rivelatore di fotoni altamente sensibile e il calcolo della funzione di autocorrelazione (ACF) del tempo di arrivo del fotone, viene misurato il passare attraverso il tempo e la luminosità delle molecole fluorescenti nel volume di rilevamento. La diffusione rallenta con un aumento del peso molecolare; pertanto, l'interazione intermolecolare può essere stimata utilizzando FCS. Ancora più potentemente, un aumento della luminosità della molecola fluorescente indica l'omo-oligomerizzazione delle molecole. Pertanto, FCS è un potente strumento per rilevare tale aggregazione proteica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

L'aggregazione proteica è un segno distintivo di disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SSS), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Huntington (MH) e così via. Per rilevare e analizzare oligomeri o aggregati proteici solubili o diffusi, è stata utilizzata la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), in grado di rilevare la velocità di diffusione e la luminosità di una singola particella con una singola sensibilità molecolare. Tuttavia, la procedura e il know-how adeguati per il rilevamento dell'aggregazione proteica non sono stati ampiamente condivisi. Qui, mostriamo una procedura standard di misurazione FCS per le proprietà di diffusione delle proteine soggette a aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive: frammento carbossile-terminale associato alla SLA di DNA/proteina legante l'RNA 43 kDa (TDP25) e superossido dismutasi 1 (SOD1). I risultati rappresentativi mostrano che una parte degli aggregati di TDP25 taggato da proteine fluorescenti verdi (GFP) è stata leggermente inclusa nella frazione solubile del neuroblastoma murino Neuro2a cell lysate. Inoltre, sod1 con tag GFP che trasporta mutazioni associate alla SS mostra una diffusione più lenta nelle cellule vive. Di conseguenza, qui introduciamo la procedura per rilevare l'aggregazione proteica attraverso la sua proprietà di diffusione utilizzando FCS.

Abbiamo eseguito la misurazione FCS di GFP-TDP25 in lisato cellulare e SOD1-G85R-GFP in cellule vive. In entrambi i casi, è stato possibile acquisire un'ampiezza positiva e aFS lisci. Abbiamo dimostrato che una porzione di GFP-TDP25 espressa in cellule Neuro2a è stata recuperata nella frazione solubile nella condizione indicata6. Nella frazione solubile del lisato cellulare, molecole di fluorescenza estremamente luminose sono state rilevate nel record di velocità di conteggio dei fotoni utilizz...

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Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Il miglior principio della spettroscopia di correlazione a fluorescenza, FCS, è stato inventato inizialmente negli anni '70. Negli anni '90, importanti e molti miglioramenti per fcs sono stati stabiliti combinando con una microscopia confocale apparato. Da allora, FCS è stato utilizzato per molte applicazioni di cura chimica e virale, come le interazioni molecolari e l'analisi dell'aggregazione proteica.L'aggregazione proteica è un segno distintivo dei disturbi neurodegenerativi. La luminosità della fluorescenza sono singole particelle in azione delle dimensioni molecolari spiegate dalle proprietà di diffusione. È molto importante nella misurazione delle aggregazioni proteiche perché può determinare i cicli di vita previsti delle molecole, ma anche distinguere l'omo o l'etero polimerizzazione.Qui, introduciamo una procedura per misurare la diffusione della sclerosi laterale amiotrofica associata a proteine a forma aggregata utilizzando FCS nei lisati cellulari e nelle cellule vive. Preparare 100 millimetri di plastica che coltiva la cellula Neuro2a seduta comodamente nel normale mezzo di crescita. Confermare la confluenza della cella.Rimuovere il supporto. Aggiungere 3,5 millilitri di soluzione trypsina-EDTA nel terzo piatto della cartuccia e incubarli a 37 gradi celsius per un minuto. Aggiungere 9,5 millilitri di mezzo di crescita normale nel piatto e sospenderli.La sospensione cellulare viene mescolata con il blu tripano per macchiare le cellule morte. Aggiungere la sospensione alla diapositiva di conteggio delle celle. Contare il numero di celle utilizzando il contatore delle celle o manualmente.Controlla il numero di cellulare vivo e la loro vitalità. Diluire la cella nel mezzo contato a 1,0 per 10 alla potenza di 5 per millilitro. Aggiungere due millilitri di sospensione cellulare nel piatto di plastica da 35 millimetri per la lisi cellulare o il piatto dello spazio di crescita per la misurazione delle cellule vive.Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per un giorno. Il giorno dopo, preparare la miscela di DNA plasmide e reagenti di trasfezione. Aggiungere la miscela di trasfezione al mezzo contato dalle cellule e incubare le cellule per 24 ore.Un giorno dopo. Controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio di routine. Potete vedere i corpi degli ingredienti TDP25 molto luminosi nelle cellule.La llisi cellulare deve essere eseguita sul banco biochimico. Rimuovere il mezzo nel piatto. Aggiungere due millilitri di PBS a 25 gradi celsius da lavare come mezzo.Rimuovere il PBS. Posizionare il piatto su una piastra di alluminio sulla parte superiore del ghiaccio frantumato. Immediatamente, aggiungere il tampone di lysis da 200 microliter nel piatto.Raschiare il piatto usando un raschietto per cellulari. Recuperare il llysate con detriti cellulari non dissolti in un nuovo tubo da 1,5 millimetri. Centrifugare il lysate a quattro gradi celsius.Per le misurazioni delle cellule vive, sostituire il mezzo con uno nuovo prima della misurazione. Controllare l'attacco cellulare utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Inoltre, controllare l'espressione GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.Utilizzare un sistema FCS combinato al microscopio confocale. Accendi il laser da 488 nanometri. Stabilizzare il sistema, almeno, per 30 minuti.Impostare il percorso ottico. Utilizzare un laser da 488 nanometri per la luce istantanea. Utilizzare uno splitter a fascio appropriato e metri dicroici.E anche, fusibili a fluorescenza. Di solito, useremo camere in vetro di copertura per la calibrazione e le misurazioni della soluzione. Con attenzione, prendi la camera di vetro di copertura.Posizionare la superficie del vetro sulla carta di screening dell'obiettivo. Versare la calibrazione FCS. Aggiungere anche la soluzione Rhodamine 6G.Aggiungere l'acqua ultrapura sull'obiettivo. Non usare l'olio. Impostare la camera sul palco del microscopio.Spostare il palco nella posizione appropriata. Create la regolazione del foro stenopeica e aprite la procedura guidata di regolazione del foro stenopeica. Monitora la velocità di conteggio dei fotoni come movimento grossolano del foro stenopeica per la direzione x.La posizione più luminosa è stata giustamente determinata. Quindi, monitora la velocità di conteggio dei fotoni come movimento fine. La posizione più luminosa è stata determinata con successo Questa è la posizione del foro stenopeica per la direzione x.Allo stesso modo, cerca la posizione più luminosa del foro stenopeica per la direzione y. Anche la posizione più luminosa per la direzione y è stata determinata con successo. Compound la posizione x e y del foro stenopeico.È meglio regolare la posizione del foro stenopeica prima della misurazione di ogni giorno. Quando il percorso live viene modificato, la posizione del foro stenopeica deve essere regolata di nuovo. Creare una frequenza di conteggio e monitorare la frequenza di conteggio del telefono.Passare alla modalità di monitoraggio CPM. Contare l'anello di correzione dell'oggetto eseguito in modo che il valore CPM sia il più alto. Chiudere la finestra della tariffa di conteggio.Inizia con la misurazione della soluzione Rhodamine 6G. Al termine della misurazione, fate clic sull'adattamento per eseguire l'analisi del raccordo curve. Selezionate un modello per il montaggio della vecchia funzione di correlazione.Per Rhodamine 6G, selezionate il modello per la diffusione tridimensionale a 1 componente con uno stato di tripletta. Impostare l'ora di inizio del raccordo spostando la linea rossa. Fate clic su Adatta tutto (Fit All), per avviare il calcolo del raccordo.Controllare la deviazione di adattamento. Assicurarsi che i lati siano registrati e negativi, intorno allo zero. Controllare i valori montati.Assicurarsi che il tempo di diffusione sia approssimativamente nell'intervallo da 20-30 microsecondi. Inoltre, il parametro strutturale va da quattro a otto. Aprite il pannello di adattamento e selezionate un modello per la misurazione.Immettete lo stesso valore del parametro strutturale nel modello per il campione nel pannello di adattamento. Assicurarsi che il tipo debba essere impostato su Fisso. Misurazione GFP-TDP25 nel llysato cellulare.Posizionare il lysate nella camera di coverglass. Posizionare il coperchio per evitare di asciugare il lisato. Posizionare il coperchio del palco per un'ombreggiatura leggera.Nel pannello di acquisizione, impostare la potenza del laser, il tempo di misurazione e le sue ripetizioni. Avviare l'acquisizione. È stato osservato un picco.Un picco è stato osservato di nuovo. Il picco indica molecole luminose passate attraverso il corpo di rilevamento. I picchi indicano oligomeri o aggregati solubili.Create un adattamento per eseguire l'analisi del raccordo a curva. Selezionate il modello per la diffusione tridimensionale a 2 componenti con stato tripletta. Impostare l'ora di inizio del raccordo.Fare clic su Adatta tutto. Controllare i valori montati. SOD1-G85R taggato con misurazione GFP in una cella viva.A differenza della misurazione della soluzione, consiglio di utilizzare l'incubatore dello stadio di calore. Impostare il piatto di 150 100 zioni sul palco del microscopio. Confermare la messa a fuoco e la posizione utilizzando l'oculare.Selezionare una cella di misura. Ingrandire e regolare la posizione della cella utilizzando una modalità di scansione rapida. Acquisire l'istantanea delle celle utilizzando la modalità di velocità di scansione lenta.Selezionate una posizione di misurazione FCS utilizzando lo strumento Posizione (Position). Il mirino indica la posizione di misura. Avviare la misurazione.La leggera diminuzione del record del tasso di conteggio dei fotoni suggerisce il fotobleaching della GFP. Eseguire il raccordo della curva. Vengono mostrati i risultati rappresentativi della GFP-TDP25 nel llysato cellulare.Il grafico superiore è un record della frequenza di conteggio dei fotoni. Dove ci sono frecce è un picco, che suggerisce oligomeri solubili e aggregati. Il grafico centrale rappresenta la vecchia funzione di correlazione.La linea grigia mostra la funzione di correlazione bassa e vecchia. La linea magenta mostra la funzione montata. Le linee tratteggiate indicano gli orari di inizio e fine per il montaggio.La tabella inferiore mostra il valore montato. Successivamente, vengono mostrati i risultati rappresentativi di SOD1-G85R-GFP in una cella viva. Il grafico superiore rappresenta un record del nostro tasso di conteggio dei fotoni.È stata osservata la graduale diminuzione del tasso di conteggio dei fotoni registrato, suggerendo il fotobleaching della crescita della FPG per diverse misurazioni. Ciò è dovuto alla lenta velocità di diffusione nelle cellule vive. Il grafico centrale rappresenta la vecchia funzione di correlazione di SOD1.La linea grigia mostra la funzione di correlazione bassa e vecchia. La linea magenta mostra la funzione montata. Le linee tratteggiate indicano gli orari di inizio e fine con il raccordo.La tabella inferiore mostra i valori montati. Qui vi mostriamo questa procedura per misurare la diffusione da ogni cellula associata TDP-25 nel lisato cellulare e tutto il mutante di SOD1 nelle cellule vive utilizzando FCS. Gli oligomeri solubili e l'aggregazione nel litolato cellulare possono essere spesso osservati come picchi o esplosioni.D'altra parte, nelle cellule vive, tali picchi sono raramente osservati, ad eccezione di strutture vive possibilmente ovvie. Una specie di SOD1 mutante che si diffonde lentamente aggiunge luminosità media per singole particelle come l'omopolimerizzazione SOD1 all'interno di noi. La procedura qui illustrata è semplice e utile.FCS non contiene radiazioni;stato direttamente dormiente. È solo la tua, e la nostra, empatia immaginativa.

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In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Rilevamento delle interazioni proteiche in pianta utilizzando un gateway compatibile complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Determinazione del Raft Lipid partizionamento delle sonde fluorescenti-tag nelle cellule viventi da spettroscopia di fluorescenza di correlazione (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging di aggregazione proteica in cellule vive

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Facile Misura di diffusione Coefficienti di EGFP-tagged plasma proteine ​​di membrana Uso k-spazio Spettroscopia di correlazione Immagine

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...