Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

A.K. ble støttet av en Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av et tilskudd fra Nakatani Foundation for Countermeasures mot nye koronavirusinfeksjoner, ved et stipend fra Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station), og et tilskudd fra Hoansha Foundation. M. K. ble delvis støttet av en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686), og en JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).

1. Materialer og reagenser
<ol><li>Bruk pyrogene frie løsninger og medium for cellekultur (Tabell 1).</li>
	<li>Forbered løsninger for det biokjemiske eksperimentet ved hjelp av ultrarent vann og bruk som DNase / RNase gratis.</li>
	<li>Velg en passende FBS for cellekulturen med mye kontrollprosess. Siden det valgte FBS-partiet endres regelmessig, kan ikke katalogen og partinummeret for FBS representeres her.</li>
	<li>Plasmid DNA<ol>
<li>Forbered pmeGFP-N15 for eGFP monomerut...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

Når det gjelder systemkalibrering før målinger, bør de samme glassene som den som ble brukt til å måle prøven brukes (f.eks. 8-brønners dekselglasskammeret for cellelys og 35 mm glassbasefat for levende celler). På grunn av adsorpsjonen av Rh6G på glasset, kan den effektive konsentrasjonen noen ganger reduseres. I så fall bør en svært konsentrert Rh6G-løsning som 1 μM brukes bare til pinhole-justeringen. Ekstremt høye fotontellingshastigheter må unngås for å beskytte detektoren (f.eks. mer enn 1000 kHz...

Proteinaggregasjoner som involverer nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Huntington sykdom og så videre1 er kjent for å være giftige og vil forstyrre protein homeostase (proteostase) i celler og organer, som deretter kan føre tilaldring 2. Clearance av proteinaggregering forventes som en terapeutisk strategi; Imidlertid er kjemikalier som forhindrer proteinaggregasjonsdannelse og nedbrytningsproteinaggregater (f.eks. små molekyler eller legemidler) ikke fastslått ennå. Videre, hvordan proteinaggregasjon utøver toksisitet forblir unnvikende. Derfor, for å fremme forskningsprosjekter relatert til proteinaggregering, er det viktig å introdusere høy gjennomstrømningsprosedyrer for å bare oppdage proteinaggregering. Proteinaggregeringsdeteksjon ved hjelp av antistoffer som gjenkjenner konformasjonen av proteinaggregasjon og aggregeringsspesifikk fluorescerende fargestoff har blitt mye brukt3. Det er imidlertid vanskelig å oppdage aggregasjonen, spesielt i levende celler ved hjelp av slike klassiske prosedyrer. 
Förster resonans energioverføring (FRET) er en prosedyre for å oppdage proteinaggregering og strukturell endring. FRET er imidlertid ikke i stand til å analysere proteindynamikk (f.eks. diffusjon og oligomerisering av protein i levende celler)3. Derfor introduserer vi her en enkel protokoll for å oppdage proteinaggregering i løsning (f.eks. cellelysat) og levende celler ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som måler diffusjonsegenskapen og lysstyrken til fluorescerende molekyler med enkeltmolekylfølsomhet4. FCS er en fotontellingsmetode ved hjelp av et laserskanningskonfokalt mikroskop (LSM). Ved hjelp av en svært følsom fotondetektor og beregning av autokorrelasjonsfunksjon (ACF) av fotonankomsttid måles passeringstiden og lysstyrken til de fluorescerende molekylene i deteksjonsvolumet. Diffusjonen bremser med en økning av molekylvekten; Intermolekylær interaksjon kan derfor estimeres ved hjelp av FCS. Enda kraftigere indikerer en økning i lysstyrken til det fluorescerende molekylet homo-oligomerisering av molekylene. Derfor er FCS et kraftig verktøy for å oppdage slik proteinaggregering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

Proteinaggregering er et kjennetegn på nevrodegenerative lidelser som amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HS) og så videre. For å oppdage og analysere løselige eller diffuse protein oligomerer eller aggregater, har fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS), som kan oppdage diffusjonshastigheten og lysstyrken til en enkelt partikkel med en enkelt molekylfølsomhet, blitt brukt. Imidlertid har riktig prosedyre og kunnskap for proteinaggregeringsdeteksjon ikke blitt mye delt. Her viser vi en standardprosedyre for FCS-måling for diffusjonsegenskaper av aggregasjonsutsatte proteiner i cellelyse og levende celler: ALS-assosiert 25 kDa karboksylterminalfragment av TAR DNA / RNA-bindende protein 43 kDa (TDP25) og superoksiddismutase 1 (SOD1). De representative resultatene viser at en del av aggregater av grønt fluorescerende protein (GFP)-merket TDP25 var litt inkludert i den oppløselige brøkdelen av murin neuroblastom Neuro2a celle lysat. Videre viser GFP-merket SOD1 med ALS-assosiert mutasjon en langsommere diffusjon i levende celler. Følgelig introduserer vi her prosedyren for å oppdage proteinaggregering via diffusjonsegenskapen ved hjelp av FCS.

Vi utførte FCS-måling av GFP-TDP25 i cellelys og SOD1-G85R-GFP i levende celler. I begge tilfeller kunne en positiv amplitude og glatte ACFer anskaffes. Vi har vist at en del av GFP-TDP25 uttrykt i Neuro2a-celler ble gjenopprettet i den oppløselige fraksjonen under den angitte tilstanden6. I den oppløselige brøkdelen av cellelyset ble det oppdaget ekstremt lyse fluorescensmolekyler i fotontellingsrekorden ved hjelp av FCS (Figur 2A, topp, pil). Slike "pigger (ogs...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Vi introduserer her en prosedyre for å måle protein oligomerer og aggregering i cellelyse og levende celler ved hjelp av fluorescens korrelasjonsspektroskopi.

Påvisning av proteinaggregering ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Det beste prinsippet om fluorescenskorrelasjonsspektroskopi, FCS, ble oppfunnet i utgangspunktet på 1970-tallet. På 1990-tallet ble viktige og mange forbedringer for FCS etablert ved å kombinere med en konfokal apparatmikroskopi. Siden da har FCS blitt brukt til mange kjemiske og viruskurapplikasjoner, for eksempel molekylære interaksjoner og proteinaggregeringsanalyse.Proteinaggregering er et kjennetegn på nevrodegenerative lidelser. Fluorescens lysstyrke er enkeltpartikler i virkning av molekylære størrelser forklart av diffusjonsegenskaper. Det er veldig viktig å måle proteinaggregering fordi det kan bestemme projiserte livssykluser av molekyler, men også skille homo- eller heteropolymeriseringen.Her introduserer vi en prosedyre for å måle diffusjon av amyotrofisk lateral sklerose forbundet med aggregert formprotein ved hjelp av FCS i cellelysater og levende celler. Forbered 100 millimeter plastfat voksende Neuro2a celle sitter komfortabelt i det normale vekstmediet. Bekreft cellesamlestyrken.Fjern mediet. Tilsett 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-oppløsning i den tredje patronfatet og inkuber dem ved 37 grader celsius i ett minutt. Tilsett 9,5 milliliter normal vekstmedium i parabolen og suspender dem.Cellesuspensjonen blandes med trypanblå for å flekke de døde cellene. Legg til suspensjon i celletellingslysbildet. Telle antall celler ved hjelp av celletelleren, eller manuelt.Sjekk live cellenummeret og deres levedyktighet. Fortynn cellen i det telte mediet ved 1,0 ganger 10 til kraften på 5 per milliliter. Tilsett to milliliter cellefjæring i 35 millimeter plastfat for cellelys eller vekstromsfat for måling av levende celler.Inkuber parabolen ved 37 grader celsius i en dag. Neste dag, forberede blandingen av plasmid DNA og transfeksjon reagenser. Tilsett transfeksjonsblandingen til det celletellingsmediet og inkuber cellene i 24 timer.En dag senere. Kontroller GFP-uttrykket ved hjelp av et rutinemessig mikroskop. Du kan se de veldig lyse TDP25 ingredienslegemene i celler.Cellelys skal utføres på den biokjemiske benken. Fjern mediet i parabolen. Tilsett to milliliter PBS ved 25 grader celsius for å vaske som et medium.Fjern PBS. Legg fatet på en aluminiumsplate på toppen av den knuste isen. Tilsett umiddelbart 200 mikroliter lysisbufferen i parabolen.Skrap parabolen ved hjelp av en celleskraper. Gjenopprett lysatet med uløst cellerester i et nytt 1,5 millimeter rør. Sentrifuger lysatet ved fire grader celsius.For måling av levende celler erstatter du mediet med et nytt før målingen. Kontroller cellevedlegget ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Kontroller også GFP-uttrykket ved hjelp av et fluorescensmikroskop.Bruk et konfokalt mikroskop-kombinert FCS-system. Slå på 488 nanometerlaseren. Stabiliser systemet, i det minste i 30 minutter.Sett opp den optiske banen. Bruk en 488 nanometerlaser for øyeblikkelig lys. Bruk en passende bjelkesplitter og dikroiske målere.Og også fluorescenssikringer. Vanligvis bruker vi dekkglasskamre for kalibrering og løsningsmålinger. Ta forsiktig dekkglasskammeret.Plasser glassoverflaten på objektivets screeningpapir. Hell FCS-kalibreringen. Tilsett Rhodamine 6G-løsningen også i.Tilsett det ultrarenne vannet på målet. Ikke bruk oljen. Sett kammeret på mikroskopstadiet.Flytt fasen til riktig posisjon. Opprett pinhole-justeringen, og åpne veiviseren for justering av flagghull. Overvåk fotontellingshastigheten som grov bevegelse av hullhullet for x-retningen.Den lyseste posisjonen ble med rette bestemt. Deretter overvåker du fotontellingshastigheten som fin bevegelse. Den lyseste posisjonen ble bestemt Dette er pinhole-posisjonen for x-retning.På samme måte, søk i den lyseste posisjonen til pinnehullet for y-retning. Den lyseste posisjonen for y-retning ble også vellykket bestemt. Foren x- og y-posisjonen til hullhullet.Det er bedre å justere pinhole-posisjonen før hver dags måling. Når den dynamiske banen endres, må pinhole-posisjonen justeres på nytt. Opprett en tellefrekvens og overvåk telefontellingsfrekvensen.Bytt til CPM-overvåkingsmodus. Tell rettelsesringen for objektet du kjørte, slik at CPM-verdien er den høyeste. Lukk tellesatsvinduet.Start med Rhodamine 6G-løsningsmålingen. Når målingen er fullført, klikker du tilpasningen for å utføre Kurvetilpasningsanalyse. Velg en modell for montering av den gamle korrelasjonsfunksjonen.For Rhodamine 6G velger du modellen for 1-komponent, 3-dimensjonal diffusjon med trillingtilstand. Still inn starttiden for tilpasningen ved å flytte den røde linjen. Klikk Tilpass alle for å starte tilpasningsberegningen.Kontroller tilpasningsavviket. Kontroller at sidene er postert og negative, rundt null. Kontroller de monterte verdiene.Sørg for at diffusjonstiden er omtrent i området fra 20-30 mikroseconds. Videre er strukturell parameter fra fire til åtte. Åpne tilpasningspanelet, og velg en modell for målingen.Angi den samme strukturelle parameterverdien i modellen for prøven i tilpasningspanelet. Kontroller at typen skal settes som Fast. GFP-TDP25-måling i cellelys.Plasser lysatet i dekkglasskammeret. Plasser lokket for å unngå å tørke opp lysatet. Plasser scenelokket for lys skyggelegging.I oppkjøpspanelet stiller du inn laserkraft, måletid og repetisjoner. Start anskaffelsen. En pigg ble observert.En pigg ble observert igjen. Piggen indikerer lyse molekyler som passerer gjennom deteksjonskroppen. Pigger indikerer løselige oligomerer eller aggregater.Lag en tilpasning for å utføre kurvetilpasningsanalyse. Velg modellen for 2-komponent, 3-dimensjonal diffusjon med trillingtilstand. Still inn starttidspunktet for tilpasningen.Klikk Tilpass til alle. Kontroller de monterte verdiene. SOD1-G85R merket med GFP-måling i en aktiv celle.I motsetning til løsningsmåling anbefaler jeg å bruke varmetrinninkubatoren. Sett den cellekulterende parabolen på mikroskopstadiet. Bekreft fokus og posisjon ved hjelp av okulær.Merk en målecelle. Zoom inn og juster celleposisjonen ved hjelp av en rask skannemodus. Skaff øyeblikksbildet av cellene ved hjelp av modus for langsom skannehastighet.Velg en FCS-måleposisjon ved hjelp av posisjonsverktøyet. Trådkorset indikerer måleposisjonen. Start målingen.Den lille nedgangen i fotontellingsfrekvensposten antyder fotobleaching av GFP. Utfør kurvetilpasningen. Representative resultater av GFP-TDP25 i cellelysat vises.Den øverste grafen en oversikt over fotontellingsfrekvens. Der det er piler er en spike, noe som tyder på løselige oligomerer og aggregater. Det midterste diagrammet representerer den gamle korrelasjonsfunksjonen.Den grå linjen viser den lave, gamle korrelasjonsfunksjonen. Den magentafargede linjen viser den monterte funksjonen. De stiplede linjene angir start- og sluttidspunktene for montering.Det nederste bordet viser den monterte verdien. Deretter vises representative resultater av SOD1-G85R-GFP i en levende celle. Den øverste grafen representerer en oversikt over antall foton.Den gradvise reduksjonen av den registrerte fotontellingshastigheten ble observert, noe som tyder på fotobleaching av GFP-vekst for forskjellige målinger. Dette er på grunn av den langsomme diffusjonshastigheten i levende celler. Det midterste diagrammet representerer den gamle korrelasjonsfunksjonen til SOD1.Den grå linjen viser den lave, gamle korrelasjonsfunksjonen. Den magentafargede linjen viser den monterte funksjonen. De stiplede linjene angir start- og sluttidspunktene med tilpasning.Den nederste tabellen viser monterte verdier. Her viser vi deg denne prosedyren for å måle diffusjon fra hver celle tilknyttet TDP-25 i cellelys og alt mutant av SOD1 i levende celler ved hjelp av FCS. De oppløselige oligomerene og aggregasjonen i cellelysat kan ofte observeres som pigger eller brister.På den annen side, i levende celler, observeres slike pigger sjelden, bortsett fra muligens åpenbare levende strukturer. En langsomt diffuserende art av mutant SOD1s legge til gjennomsnittlig lysstyrke for enkeltpartikler som SOD1 homopolymerisering inne for oss. Prosedyren som vises her er enkel og verdt.FCS inneholder ingen stråling;direkte sovende tilstand. Det er bare din og vår fantasiempati.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Påvisning av nitrogenoksid og Superoxide Radical anion med Electron paramagnetisk resonans spektroskopi fra celler ved hjelp av Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestemmelse av Lipid Raft Partisjonering av fluorescently-merkede prober i levende celler ved fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning av virale RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging of Protein Aggregation i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Easy Måling av diffusjonskoeffisienter av EGFP-merket plasma membran Proteiner Bruke k-Space Bilde Korrelasjon spektroskopi

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...