Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
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A.K. foi apoiada por uma Sociedade Japonesa de Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), por uma subvenção da Fundação Nakatani para Contramedidas contra novas infecções por coronavírus, por uma bolsa do Escritório da Universidade de Hokkaido para o Desenvolvimento de Futuros Líderes de Pesquisa (L-Station), e uma subvenção da Fundação Hoansha. M. K. foi parcialmente apoiado por um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686), e um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).

1. Materiais e reagentes
<ol><li>Use soluções livres pirogênicas e médias para cultura celular(Tabela 1).</li>
	<li>Prepare soluções para o experimento bioquímico usando água ultrauso e use como DNase/RNase livre.</li>
	<li>Selecione um FBS apropriado para a cultura celular com um processo de verificação de lotes. Uma vez que o lote selecionado da FBS muda regularmente, o catálogo e o número do lote para FBS não podem ser representados aqui.</li>
	<li>DNA plasmídeo<ol>
<li>Prepare pmeGFP-...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para p...

Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim pordiante 1 são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento2. Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agregação de proteínas exerce toxicidade permanece indescritível. Portanto, para promover projetos de pesquisa relacionados à agregação de proteínas, é importante introduzir procedimentos de alto rendimento para simplesmente detectar a agregação de proteínas. A detecção de agregação de proteínas usando anticorpos que reconhecem a conformação da agregação de proteínas e do corante fluorescente específico para agregação tem sido amplamente utilizada3. No entanto, é difícil detectar a agregação, especialmente em células vivas usando tais procedimentos clássicos. 
A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um procedimento para detectar agregação de proteínas e mudanças estruturais. No entanto, o FRET é incapaz de analisar a dinâmica proteica (por exemplo, difusão e oligomerização da proteína em células vivas)3. Por isso, introduzimos aqui um protocolo simples para detectar a agregação de proteínas em solução (por exemplo, lisato celular) e células vivas utilizando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que mede a propriedade de difusão e brilho de moléculas fluorescentes com sensibilidade de molécula única4. FCS é um método de contagem de fótons usando um microscópio confocal de varredura a laser (LSM). Utilizando um detector de fótons altamente sensível e o cálculo da função de autocorrelação (ACF) do tempo de chegada do fóton, a passagem pelo tempo e brilho das moléculas fluorescentes no volume de detecção é medida. A difusão diminui com o aumento do peso molecular; assim, a interação intermolecular pode ser estimada usando FCS. Ainda mais fortemente, um aumento no brilho da molécula fluorescente indica homo-oligomerização das moléculas. Portanto, a FCS é uma ferramenta poderosa para detectar tal agregação de proteínas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.

Realizamos a medição fcs de GFP-TDP25 em lisesto celular e SOD1-G85R-GFP em células vivas. Em ambos os casos, foram capazes de ser adquiridas uma amplitude positiva e acfs suaves. Mostramos que uma parte do GFP-TDP25 expressa em células Neuro2a foi recuperada na fração solúvel sob a condição indicada6. Na fração solúvel do liseto celular, foram detectadas moléculas de fluorescência extremamente brilhantes no registro da taxa de contagem de fótons usando FCS (Fig...

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Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

O melhor princípio da espectroscopia de correlação da fluorescência, FCS, foi inventado inicialmente na década de 1970. Na década de 1990, importantes e muitas melhorias para a FCS foram estabelecidas pela combinação com uma microscopia de aparelho confocal. Desde então, a FCS tem sido usada para muitas aplicações químicas e de cura de vírus, como interações moleculares e análise de agregação de proteínas.A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativos. Brilho de fluorescência são partículas únicas em ação de tamanhos moleculares explicados por propriedades de difusão. É muito importante medir agregações proteicas porque pode determinar ciclos de vida projetados de moléculas, mas também distinguir a polimerização homo ou hetero.Aqui, introduzimos um procedimento para medir a difusão da esclerose lateral amiotrófica associada à proteína de forma agregada utilizando FCS em células lísatos e células vivas. Prepare 100 milímetros de prato plástico cultivando células Neuro2a sentadas confortavelmente no meio de crescimento normal. Confirme a confluência celular.Remova o meio. Adicione 3,5 mililitros de solução Trypsin-EDTA no terceiro prato de cartucho e incuba-os a 37 graus celsius por um minuto. Adicione 9,5 mililitros de crescimento normal no prato e suspenda-os.A suspensão celular é misturada com azul trypan para manchar as células mortas. Adicione suspensão ao slide de contagem de células. Conte o número de células usando o contador de células, ou manualmente.Verifique o número do celular ao vivo e sua viabilidade. Diluir a célula no meio contado em 1,0 vezes 10 para a potência de 5 por mililitro. Adicione dois mililitros de suspensão celular na antena plástica de 35 milímetros para lise celular ou prato de espaço de crescimento para medição de células vivas.Incubar o prato a 37 graus celsius por um dia. No dia seguinte, prepare a mistura de DNA plasmídeo e os reagentes de transfecção. Adicione a mistura de transfecção ao meio contado por células e incubar as células por 24 horas.Um dia depois. Verifique a expressão GFP usando um microscópio de rotina. Você pode ver os corpos de ingredientes TDP25 muito brilhantes nas células.A lise celular deve ser realizada no banco bioquímico. Retire o meio no prato. Adicione dois mililitros de PBS a 25 graus celsius para lavar como meio.Remova o PBS. Coloque o prato em uma placa de alumínio no topo do gelo esmagado. Imediatamente, adicione o tampão de 200 microliter lysis no prato.Raspe o prato usando um raspador de células. Recupere o lise com detritos celulares não resolvidos em um novo tubo de 1,5 milímetros. Centrifugar o lise a quatro graus celsius.Para medições de células vivas, substitua o meio por um fresco antes da medição. Verifique o acessório da célula usando um microscópio de contraste de fase. Além disso, verifique a expressão GFP usando um microscópio de fluorescência.Use um sistema FCS combinado com microscópio confocal. Ligue o laser de 488 nanômetros. Estabilize o sistema, pelo menos, por 30 minutos.Configure o caminho óptico. Use um laser de 488 nanômetros para a luz instantânea. Use um divisor de vigas apropriado e medidoresdicróicos.E também, fusores de fluorescência. Normalmente, usaremos câmaras de vidro para calibração e medições de soluções. Com cuidado, pegue a câmara de vidro de cobertura.Coloque a superfície de vidro no papel de triagem da lente. Despeje a calibração FCS. Adicione a solução Rhodamine 6G também.Adicione a água ultrauso no objetivo. Não use o óleo. Coloque a câmara no palco do microscópio.Mova o palco para a posição apropriada. Crie o ajuste do orifício e abra o assistente de ajuste do orifício. Monitore a taxa de contagem de fótons como movimento grosseiro do pinhole para a direção x.A posição mais brilhante foi justamente determinada. Em seguida, monitore a taxa de contagem de fótons como movimento fino. A posição mais brilhante foi determinada com sucesso Esta é a posição pinhole para x-direção.Da mesma forma, procure a posição mais brilhante do pinhole para y-direção. A posição mais brilhante para a direção y também foi determinada com sucesso. Compondo a posição x e y do orifício.É melhor ajustar a posição do orifício antes da medição de cada dia. Quando o caminho ao vivo é alterado, a posição do orifício deve ser ajustada novamente. Crie uma taxa de contagem e monitore a taxa de contagem de telefones.Altere para o modo de monitoramento do CPM. Conte o anel de correção do objeto que você executou para que o valor do CPM seja o mais alto. Feche a janela de taxa de contagem.Comece com a medição da solução Rhodamine 6G. Após a conclusão da medição, clique no ajuste para realizar a Análise de Montagem da Curva. Selecione um modelo para montagem da antiga função de correlação.Para Rhodamine 6G, selecione o modelo para difusão tridimensional de 1 componente com um estado trigêmeo. Ajuste o tempo de início de montagem movendo a linha vermelha. Clique em Encaixar Tudo, para iniciar o cálculo de encaixe.Verifique o desvio de ajuste. Certifique-se de que os lados estão postados e negativos, em torno de zero. Verifique os valores ajustados.Certifique-se de que o tempo de difusão esteja aproximadamente na faixa de 20-30 microsegundos. Além disso, o parâmetro estrutural é de quatro a oito. Abra o painel de ajuste e selecione um modelo para a medição.Digite o mesmo valor de parâmetro estrutural no modelo para a amostra no painel de ajuste. Certifique-se de que o tipo deve ser definido como Fixo. Medição GFP-TDP25 em lise celular.Coloque o lise na câmara de vidro de cobertura. Coloque a tampa para evitar secar o lise. Coloque a tampa do palco para sombreamento leve.No painel de aquisição, defina a potência do laser, o tempo de medição e suas repetições. Comece a aquisição. Um pico foi observado.Um pico foi observado novamente. O pico indica moléculas brilhantes passadas pelo corpo de detecção. Picos indicam oligômeros solúveis ou agregados.Crie um ajuste para realizar a análise de ajuste de curva. Selecione o modelo para difusão tridimensional de 2 componentes com estado trigêmeo. Ajuste a hora de início da montagem.Clique no Fit All. Verifique os valores ajustados. SOD1-G85R marcado com medição GFP em uma célula viva.Ao contrário da medição da solução, recomendo o uso da incubadora do estágio de calor. Coloque o prato de cultivo de células no estágio do microscópio. Confirme o foco e a posição usando o ocular.Selecione uma célula de medição. Zoom-in e ajuste a posição da célula usando um modo de varredura rápida. Adquira o instantâneo das células usando o modo de velocidade de varredura lenta.Selecione uma posição de medição FCS usando a ferramenta Posição. A mira indica a posição de medição. Comece a medição.A ligeira diminuição do registro da taxa de contagem de fótons sugere fotobleaching de GFP. Realize o encaixe da curva. Resultados representativos de GFP-TDP25 no lysate celular são mostrados.O gráfico superior um registro de taxa de contagem de fótons. Onde há flechas é um pico, sugerindo oligômeros solúveis e agregados. O gráfico médio representa a antiga função de correlação.A linha cinza mostra a função de correlação baixa e antiga. A linha magenta mostra a função instalada. As linhas pontilhadas indicam os tempos de partida e fim para a montagem.A tabela inferior mostra o valor ajustado. Em seguida, resultados representativos de SOD1-G85R-GFP em uma célula viva são mostrados. O gráfico superior representa um registro da nossa taxa de contagem de fótons.Observou-se a diminuição gradual da taxa de contagem de fótons registrada, sugerindo fotoblema do crescimento do GFP para diferentes medições. Isso é por causa da velocidade de difusão lenta em células vivas. O gráfico médio representa a antiga função de correlação do SOD1.A linha cinza mostra a função de correlação baixa e antiga. A linha magenta mostra a função montada. As linhas pontilhadas indicam os tempos de partida e fim com a montagem.A tabela inferior mostra valores ajustados. Aqui mostramos este procedimento para medir a difusão de cada célula associada ao TDP-25 em lise celular e tudo o que é mutante de SOD1 em células vivas usando FCS. Os oligômeros solúveis e a agregação no lysato celular podem ser frequentemente observados como picos ou rajadas.Por outro lado, em células vivas, tais picos raramente são observados, exceto por estruturas vivas possivelmente óbvias. Uma espécie de SOD1 mutante adiciona brilho médio para partículas únicas como a homopolimerização SOD1 dentro para nós. O procedimento aqui mostrado é simples e vale a pena.FcS não contém radiação;estado diretamente adormecido. É só sua empatia e imaginação.

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Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...