Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

А.К. был поддержан Японского общества содействия науке (JSPS) Грант-в-помощи для научных исследований (C) (#18K06201), грант в помощь от Фонда Накатани по борьбе с новыми коронавирусных инфекций, грант от Университета Хоккайдо Управление по развитию будущих лидеров исследований (L-Station), а также грант в помощь от Hoansha Фонда. М.К. была частично поддержана грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Химия для многомолекулярных краудинговых биосистем" (#20H04686) и грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Информационная физика живых дел" (#20H05522).

1. Материалы и реагенты
<ol><li>Используйте пирогенные свободные растворы и средние для клеточной культуры(таблица 1).</li>
	<li>Подготовка решений для биохимического эксперимента с использованием ультрачистой воды и использовать в качестве DNase / RNase бесплатно.</li>
	<li>Выберите подходя?...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная конце?...

Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, итак далее 1, как известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести кстарению 2. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым. Поэтому для продвижения исследовательских проектов, связанных с агрегацией белка, важно ввести процедуры высокой пропускной способности, чтобы просто обнаружить агрегацию белка. Обнаружение агрегации белка с использованием антител, распознающих конформацию агрегации белка и агрегации специфических флуоресцентных красителей широко используется3. Однако, трудно обнаружить агрегацию, особенно в живых клетках с помощью таких классических процедур. 
Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET) является процедура для обнаружения агрегации белка и структурных изменений. Тем не менее, FRET не в состоянии анализировать белковую динамику (например, диффузию и олигомеризацию белка в живых клетках)3. Поэтому мы вводим здесь простой протокол для обнаружения агрегации белка в растворе (например, лисате клеток) и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии (FCS), которая измеряет диффузионные свойства и яркость флуоресцентных молекул с однойчувствительностью молекулы 4. FCS — это метод фотон-подсчета с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа (LSM). Используя высокочувствительный фотон-детектор и расчет функции автокорреляции (ACF) времени прибытия фотона, измеряется проход во времени и яркость флуоресцентных молекул в объеме обнаружения. Диффузия замедляется с увеличением молекулярного веса; таким образом, интермолекулярное взаимодействие можно оценить с помощью FCS. Еще мощнее, увеличение яркости флуоресцентной молекулы указывает на гомо-олигомеризацию молекул. Таким образом, FCS является мощным инструментом для обнаружения такой агрегации белка.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.

Мы провели измерение FCS GFP-TDP25 в лизаторе клеток и SOD1-G85R-GFP в живых клетках. В обоих случаях удалось приобрести положительную амплитуду и гладкие ACF. Мы показали, что часть GFP-TDP25, выраженная в клетках Neuro2a, была восстановлена в растворимой фракции при указанном состоянии6. В раст...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.

Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Лучший принцип спектроскопии корреляции флуоресценции, FCS, был изобретен первоначально в 1970-х годах. В 1990-х годах, важные и многие улучшения для FCS была создана путем объединения с конфокальные микроскопии аппарата. С тех пор FCS используется для многих химических и вирусных приложений лечения, таких как молекулярные взаимодействия и анализ агрегации белка.Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств. Яркость флуоресценции – это одиночные частицы в действии молекулярных размеров, которые объясняются диффузионные свойствами. Это очень важно в измерении агрегации белка, потому что он может определить прогнозируемые жизненные циклы молекул, но и различать гомо или гетеро полимеризации.Здесь мы вводим процедуру измерения диффузии бокового амиотрофического склероза, связанного с агрегированным протеином формы с использованием FCS в клеточных лизорах и живых клетках. Приготовьте 100-миллиметровую пластиковую тарелку, растущую в клетке Neuro2a, удобно сидящую в нормальной среде роста. Подтвердите слияние клеток.Удалите носитель. Добавьте 3,5 миллилитров раствора Трипсин-ЭДТА в третье блюдо картриджа и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение одной минуты. Добавить 9,5 миллилитров нормального роста среды в блюдо и приостановить их.Подвеска клетки смешана с трипан-синим цветом, чтобы испачкать мертвые клетки. Добавьте подвеску к слайду подсчета ячееок. Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек или вручную.Проверьте живой номер ячейки и их жизнеспособность. Разбавить ячейку в подсчитанной среде в 1,0 раза 10 до мощности 5 на миллилитр. Добавьте два миллилитров клеточной суспензии в 35-миллиметровую пластиковую тарелку для клеточного лиза или пространство роста для измерения живых клеток.Инкубировать блюдо при 37 градусах по Цельсию в течение одного дня. На следующий день приготовьте смесь плазмидной ДНК и трансфектных реагентов. Добавьте смесь трансфекции в клеточную среду и инкубировать клетки в течение 24 часов.Один день спустя. Проверьте выражение GFP с помощью обычного микроскопа. Вы можете увидеть очень яркие тела ингредиента TDP25 в клетках.Клеточныйлиз следует проводить на биохимической скамейке. Удалите среду в блюдо. Добавить два миллилитров PBS при 25 градусах по Цельсию, чтобы мыть как средство.Удалите PBS. Поместите блюдо на алюминиевую тарелку поверх дробленого льда. Немедленно добавьте буфер лиза микролитера 200 в тарелку.Очисти блюдо с помощью клеточного скребка. Восстановите лизат с неоконсеримым клеточным мусором в новой 1,5-миллиметровой трубке. Центрифуга лисировать при четырех градусах по Цельсию.Для измерения живых клеток замените носитель на свежий перед измерением. Проверьте вложение клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. Кроме того, проверьте выражение GFP с помощью флуоресцентной микроскопа.Используйте конфокальцированную систему FCS, комбинированную с микроскопом. Включите 488 нанометровый лазер. Стабилизировать систему, по крайней мере, в течение 30 минут.Настройка оптического пути. Используйте 488 нанометровый лазер для мгновенного света. Используйте соответствующий пучок сплиттера и дихроических метров.А также, флиоресценции предохранители. Как правило, мы будем использовать крышки камер для калибровки и измерения раствора. Осторожно, возьмите крышку камеры.Поместите стеклянную поверхность на скрининговую бумагу объектива. Налейте калибровку FCS. Добавить раствор родамин 6G, а также.Добавьте ультрачистую воду на цель. Не используйте масло. Установите камеру на сцене микроскопа.Перемести сцену в соответствующее положение. Создайте регулировку пинхол и откройте мастер регулировки пинхол. Мониторинг скорости подсчета фотона как грубого движения пинхол для x-направления.Самая яркая позиция была правильно определена. Далее, контролировать скорость подсчета фотона, как тонкое движение. Самая яркая позиция была успешно определена Это положение пинхол для X-направления.Точно так же ищите самое яркое положение пинхол для направления y. Также была успешно определена самая яркая позиция по у-направлению. Соединение x и y положение пинхол.Лучше настроить положение пинхол перед каждым днем измерения. Когда живой путь изменен, положение пинхол должно быть отрегулировано снова. Создайте скорость подсчета и отслеживайте скорость подсчета телефона.Изменение режима мониторинга CPM. Подсчитайте кольцо коррекции объекта, который вы запустили, чтобы значение CPM было самым высоким. Закройте окно скорости подсчета.Начните с измерения раствора Rhodamine 6G. После завершения измерения щелкните припадок для выполнения анализа кривой установки. Выберите модель для установки старой функции корреляции.Для Rhodamine 6G выберите модель для 1-компонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Установите подходящее время начала, перемещая красную линию. Нажмите Fit All, чтобы начать подходящий расчет.Проверьте пригонку отклонения. Убедитесь, что стороны размещены и отрицательные, около нуля. Проверьте установленные значения.Убедитесь, что время диффузии примерно в диапазоне от 20-30 микросекунд. Кроме того, структурный параметр составляет от четырех до восьми. Откройте подгонку панели, и выбрать модель для измерения.Введите то же структурное значение параметра в модели для образца в пригонка панели. Убедитесь, что тип должен быть установлен как фиксированный. Измерение GFP-TDP25 в лизации клеток.Поместите лисат в камеру крышки. Поместите крышку, чтобы избежать высыхания лисата. Поместите крышку сцены для светлого затенения.В панели приобретения установите мощность лазера, время измерения и его повторения. Начните приобретение. Наблюдался всплеск.Снова наблюдался всплеск. Шип указывает на яркие молекулы, проходят через тело обнаружения. Спайки указывают на растворимые олигомеры или агрегаты.Создайте пригонку для выполнения анализа установки кривой. Выберите модель для 2-компонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Установите подходящее время начала.Нажмите Fit All. Проверьте установленные значения. SOD1-G85R помечены измерения GFP в живой клетке.В отличие от измерения раствора, я рекомендую использовать инкубатор тепловой стадии. Установите клеточное блюдо на сцене микроскопа. Подтвердите фокус и положение с помощью глаз.Выберите измерительную ячейку. Увеличьте масштаб и отрегулируйте положение ячейки с помощью режима быстрого сканирования. Приобрети снимок ячеек с помощью режима медленного сканирования.Выберите положение измерения FCS с помощью инструмента Позиции. Перекрестие указывает на измерительное положение. Начало измерения.Небольшое снижение записи скорости подсчета фотона говорит о фотоотводе GFP. Выполните установку кривой. Показаны репрезентативные результаты GFP-TDP25 в лизации ячеей.Верхний график запись скорости подсчета фотона. Там, где есть стрелки шип, предлагая растворимые олигомеры и агрегаты. Средний график представляет старую функцию корреляции.Серая линия показывает низкую, старую функцию корреляции. Пурпурная линия показывает установленную функцию. Пунктирные линии указывают время начала и конца установки.В нижней таблице показано установленное значение. Далее показаны репрезентативные результаты SOD1-G85R-GFP в живой ячейке. Верхний график представляет собой запись нашей скорости подсчета фотона.Наблюдалось постепенное снижение зарегистрированной скорости подсчета фотона, что свидетельствует о фотоотчете роста GFP для различных измерений. Это связано с медленной скоростью диффузии в живых клетках. Средний график представляет старую корреляционные функции SOD1.Серая линия показывает низкую, старую функцию корреляции. Пурпурная линия показывает установленную функцию. Пунктирные линии указывают время начала и конца установки.В нижней таблице показаны установленные значения. Здесь мы покажем вам эту процедуру для измерения диффузии от каждой ячейки, связанной TDP-25 в лицате клеток и все мутант SOD1 в живых клетках с помощью FCS. Растворимые олигомеры и агрегация в лисате клеток часто можно наблюдать как шипы или очередей.С другой стороны, в живых клетках такие всплески наблюдаются редко, за исключением, возможно, очевидных живых структур. Медленно диффузных видов мутантов SOD1 добавить среднее яркость для отдельных частиц, таких как SOD1 гомополимеризации внутри для нас. Процедура, показанная здесь, проста и стояща.FCS не содержит излучения; непосредственно спящее состояние. Это просто ваше и наше воображение сопереживание.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

Обнаружение белка убиквитинирования

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) Пробирной для белок-белковые взаимодействия в Лук ячеек с использованием генной пушки Helios

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

В естественных условиях обнаружения белок-белковых взаимодействий на микро-узорной поверхности

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Определение оксида азота и супероксид анион-радикал электронов парамагнитного резонанса от клеток с использованием спиновых ловушек

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Обнаружение белковых взаимодействий в завод использованием шлюза Совместимость комплементации флуоресценции Бимолекулярные (BiFC) Системные

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Определение липидного плота разделов флуоресцентно с метками зонды в живых клетках при флуоресцентной спектроскопии корреляции (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Легко Измерение коэффициентов диффузии в EGFP-меченых белков плазматической мембраны Использование К-пространство изображения корреляционной спектроскопии

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...