Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

A.K. stöddes av ett bidrag från Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), av ett stöd från Nakatani Foundation for Countermeasures mot nya coronavirusinfektioner, genom ett bidrag från Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) och ett bidrag i bistånd från Hoansha Foundation. M. K. stöddes delvis av ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Kemi för multimolekylära crowdingbiosystem" (#20H04686) och ett JSPS-bidrag till vetenskaplig forskning om innovativa områden "Informationsfysik i levande frågor" (#20H05522).

1. Material och reagenser
<ol><li>Använd pyrogena fria lösningar och medium för cellkultur (tabell 1).</li>
	<li>Förbered lösningar för det biokemiska experimentet med ultrapurevatten och använd som DNase / RNase gratis.</li>
	<li>Välj en lämplig FBS för cellkulturen med mycket kontrollprocess. Eftersom det valda FBS-partiet ändras regelbundet kan katalogen och partinumret för FBS inte representeras här.</li>
	<li>Plasmid DNA<ol>
<li>Förbered pmeGFP-N15 för eGFP m...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

När det gäller systemkalibrering före mätningar bör samma glas som det som används för att mäta provet användas (t.ex. täcker 8-brunnarna glaskammaren för celllyat och 35 mm glasbasform för levande celler). På grund av adsorptionen av Rh6G på glaset kan dess effektiva koncentration ibland minska. I så fall bör en högkoncentrerad Rh6G-lösning som 1 μM användas endast för pinhole-justeringen. Extremt höga fotonantal måste undvikas för att skydda detektorn (t.ex. mer än 1000 kHz). Dessutom är den k...

Proteinaggregeringar som involverar neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, Huntingtons sjukdom och såvidare 1 är kända för att vara giftiga och skulle störa proteinhomeostas (proteostas) i cellerna och organen, som sedan kan leda till åldrande2. Clearance av proteinaggregering förväntas som en terapeutisk strategi; Kemikalier som förhindrar proteinaggregeringsbildning och bryter ned proteinaggregat (t.ex. små molekyler eller läkemedel) har dock ännu inte fastställts. Dessutom är hur proteinaggregering utövar toxicitet fortfarande svårfångad. För att främja forskningsprojekt relaterade till proteinaggregering är det därför viktigt att införa förfaranden med hög genomströmning för att helt enkelt upptäcka proteinaggregering. Protein aggregering upptäckt med antikroppar som erkänner konformation av protein aggregering och aggregering-specifika fluorescerande färgämne har använts i stor utsträckning3. Det är dock svårt att upptäcka aggregeringen, särskilt i levande celler med sådana klassiska procedurer. 
Förster resonans energiöverföring (FRET) är ett förfarande för att upptäcka proteinaggregering och strukturell förändring. FRET kan dock inte analysera proteindynamik (t.ex. diffusion och oligomerisering av protein i levande celler)3. Därför introducerar vi här ett enkelt protokoll för att upptäcka proteinaggregering i lösning (t.ex. celllyat) och levande celler med fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som mäter diffusionsegenskapen och ljusstyrkan hos fluorescerande molekyler med en molekylkänslighet4. FCS är en fotonräkningsmetod med hjälp av ett lsm(laser scan confocal microscope). Med hjälp av en mycket känslig fotondetektor och beräkning av autokorrelationsfunktion (ACF) av foton ankomsttid mäts genom tiden och ljusstyrkan hos fluorescerande molekyler i detektionsvolymen. Diffusionen saktar med en ökning av molekylvikten; Intermolecular interaktion kan således uppskattas med FCS. Ännu kraftfullare är att en ökning av ljusstyrkan hos den fluorescerande molekylen indikerar homo-oligomerisering av molekylerna. Därför är FCS ett kraftfullt verktyg för att upptäcka sådan proteinaggregering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS), Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och så vidare. För att upptäcka och analysera lösliga eller diffusa proteinoligomer eller aggregat har fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), som kan detektera diffusionshastigheten och ljusstyrkan hos en enda partikel med en enda molekylkänslighet, använts. Det korrekta förfarandet och know-how för proteinaggregeringsdetektering har dock inte delats i stor utsträckning. Här visar vi ett standardförfarande för FCS-mätning för diffusionsegenskaper hos aggregeringsbenägna proteiner i celllyat och levande celler: ALS-associerade 25 kDa karboxylterminalfragment av TAR DNA/ RNA-bindande protein 43 kDa (TDP25) och superoxiddemutas 1 (SOD1). De representativa resultaten visar att en del av aggregat av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt TDP25 var något ingår i den lösliga fraktionen av murin neuroblastom Neuro2a cell lysat. Dessutom visar GFP-märkta SOD1 bär ALS-associerade mutation en långsammare diffusion i levande celler. Följaktligen introducerar vi här proceduren för att upptäcka proteinaggregeringen via dess diffusionsegenskap med FCS.

Vi utförde FCS mätning av GFP-TDP25 i cell lysat och SOD1-G85R-GFP i levande celler. I båda fallen kunde en positiv amplitud och smidiga ACFs förvärvas. Vi har visat att en del av GFP-TDP25 uttryckt i Neuro2a celler återfanns i lösliga fraktion under det angivnavillkoret 6. I den lösliga fraktionen av celllysatet upptäcktes extremt ljusa fluorescensmolekyler i fotonräkningshastigheten med FCS (Figur 2A, topp, pil). Sådana "spikar (även kallade burst)" obse...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Vi inför här ett förfarande för att mäta protein oligomerer och aggregering i cell lysat och levande celler med fluorescens korrelation spektroskopi.

Påvisande av proteinaggregering med fluorescenskorrelationsspektroskopi

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Den bästa principen för Fluorescenskorrelationsspektroskopi, FCS, uppfanns ursprungligen på 1970-talet. På 1990-talet inrättades viktiga och många förbättringar för FCS genom att kombineras med en konfokal apparatmikroskopi. Sedan dess har FCS använts för många kemiska och virushärdande applikationer, såsom molekylära interaktioner och proteinaggregeringsanalys.Proteinaggregering är ett kännetecken för neurodegenerativa störningar. Fluorescensens ljusstyrka är enstaka partiklar i funktion av molekylära storlekar som förklaras av diffusionsegenskaper. Det är mycket viktigt vid mätning av proteinaggregeringar eftersom det kan bestämma projicerade livscykler av molekyler, men också skilja homo eller heteropolymerisering.Här introducerar vi ett förfarande för att mäta diffusion av amyotrofisk laterala skleros är associerad med aggregerat formprotein med FCS i cell lysates och levande celler. Förbered 100 millimeters plasträtt som växer Neuro2a-cell som sitter bekvämt i det normala tillväxtmediet. Bekräfta cellkonfluensen.Ta bort mediet. Tillsätt 3,5 milliliter Trypsin-EDTA-lösning i den tredje patronskålen och inkubera dem vid 37 grader celsius i en minut. Tillsätt 9,5 milliliter normalt tillväxtmedium i skålen och häng upp dem.Cellupphängningen blandas med trypanblått för att färga de döda cellerna. Lägg till fjädring i cellräkningsbilden. Räkna antalet celler som använder cellräknaren eller manuellt.Kontrollera det levande cellnumret och deras livskraft. Späd cellen i det räknade mediet vid 1,0 gånger 10 till kraften av 5 per milliliter. Tillsätt två milliliter cellfjädring i den 35 millimeter stora plastformen för celllys eller tillväxtutrymmesform för levande cellmätning.Inkubera skålen vid 37 grader celsius för en dag. Nästa dag, förbered blandningen av plasmid-DNA och transfection reagenserna. Tillsätt transfektionsblandningen i det cellräknade mediet och inkubera cellerna i 24 timmar.En dag senare. Kontrollera GFP-uttrycket med ett rutinmikroskop. Du kan se de mycket ljusa TDP25-ingredienskropparna i celler.Celllys bör utföras på den biokemiska bänken. Ta bort mediet i skålen. Tillsätt två milliliter PBS vid 25 grader celsius för att tvätta som medium.Ta bort PBS.Remove the PBS. Placera skålen på en aluminiumplatta ovanpå den krossade isen. Tillsätt omedelbart 200 mikroliterlysbufferten i skålen.Skrapa skålen med en cellskrapa. Återvinn lysatet med olöst cellskräp i ett nytt 1,5 millimeters rör. Centrifugera lysatet vid fyra grader celsius.För levande cellmätningar, byt ut mediet mot ett nytt före mätningen. Kontrollera celltillbehöret med hjälp av ett faskontrastmikroskop. Kontrollera också GFP-uttrycket med hjälp av ett fluorescensmikroskop.Använd ett konfokalt mikroskop-kombinerat FCS-system. Slå på lasern på 488 nanometer. Stabilisera systemet i minst 30 minuter.Ställ in den optiska banan. Använd en laser på 488 nanometer för direktljuset. Använd en lämplig strålklytare och dichroiska mätare.Och även fluorescenssäkringar. Vanligtvis använder vi täckglaskammare för kalibrering och lösningsmätningar. Ta försiktigt täckglaskammaren.Placera glasytan på linsens sållningspapper. Häll FCS-kalibreringen. Tillsätt rhodamin 6G-lösningen också.Tillsätt ultrapurevatten på målet. Använd inte oljan. Ställ in kammaren på mikroskopstadiet.Flytta scenen till rätt position. Skapa pinhole-justeringen och öppna guiden för justering av pinhole. Övervaka fotonantalet som grov rörelse av pinhålet för x-riktningen.Den ljusaste positionen var med rätta bestämd. Övervaka sedan fotonräkningshastigheten som fin rörelse. Den ljusaste positionen har fastställts Detta är pinhole-positionen för x-riktning.På samma sätt söker du i pinhålets ljusaste position efter y-riktning. Den ljusaste positionen för y-riktning fastställdes också framgångsrikt. Förvärra pinhålets x- och y-läge.Det är bättre att justera pinhole-läget före varje dags mätning. När huvudbanan ändras måste pinhole-läget justeras igen. Skapa en räkningshastighet och övervaka antalet telefoner.Ändra till CPM-övervakningsläget. Räkna korrigeringsringen för objektet du körde så att CPM-värdet är det högsta. Stäng fönstret för räknehastighet.Börja med mätningen av Rhodamine 6G-lösningen. När mätningen är klar klickar du på passformen för att utföra kurvmonteringsanalys. Välj en modell för montering av den gamla korrelationsfunktionen.För Rhodamine 6G, välj modell för 1-komponent, 3-dimensionell diffusion med trillingtillstånd. Ställ in monteringsstarttiden genom att flytta den röda linjen. Klicka på Anpassa alla för att starta monteringsberäkningen.Kontrollera passformsavvikelsen. Se till att sidorna är bokförda och negativa, runt noll. Kontrollera de monterade värdena.Se till att diffusionstiden är ungefär inom intervallet 20-30 mikroseseconds. Dessutom är strukturell parameter från fyra till åtta. Öppna passformspanelen och välj en modell för mätningen.Ange samma strukturella parametervärde i modellen för exemplet på panelen Passa. Kontrollera att typen ska ställas in som Fast. GFP-TDP25-mätning i celllysat.Placera lysatet i täckglaskammaren. Placera locket för att undvika att lyset torkas upp. Placera scenlocket för lätt skuggning.Ställ in lasereffekten, mättiden och dess upprepningar i förvärvspanelen. Starta förvärvet. En spik observerades.En spik observerades igen. Spiken indikerar ljusa molekyler som passerar genom detektionskroppen. Spikar indikerar lösliga oligomerer eller aggregat.Skapa en passform för att utföra kurvmonteringsanalys. Välj modell för 2-komponents, 3-dimensionell diffusion med trillingtillstånd. Ställ in monteringsstarttiden.Klicka på Anpassa alla. Kontrollera de monterade värdena. SOD1-G85R märkt med GFP-mätning i en levande cell.Till skillnad från lösningsmätning rekommenderar jag att du använder värmestegsinkubatorn. Ställ in cellodlingsskålen på mikroskopstadiet. Bekräfta fokus och position med hjälp av okulären.Markera en mätcell. Zooma in och justera cellpositionen med ett snabbt skanningsläge. Hämta ögonblicksbilden av cellerna med hjälp av läget långsam skanningshastighet.Välj en FCS-mätposition med hjälp av positionsverktyget. Hårkorset anger mätpositionen. Starta mätningen.Den lilla minskningen av fotonräkningshastigheten tyder på fotoblekning av GFP. Utför kurvkopplingen. Representativa resultat av GFP-TDP25 i celllyat visas.Det översta diagrammet är en post med antal fotoner. Där det finns pilar är en spik, vilket tyder på lösliga oligomerer och aggregat. Det mellersta diagrammet representerar den gamla korrelationsfunktionen.Den grå linjen visar den låga, gamla korrelationsfunktionen. Magentalinjen visar den monterade funktionen. De prickade linjerna anger start- och sluttiderna för montering.Den nedre tabellen visar det monterade värdet. Därefter visas representativa resultat av SOD1-G85R-GFP i en levande cell. Det översta diagrammet representerar en post över vår fotonräkningshastighet.Den gradvisa minskningen av den registrerade fotonräkningshastigheten observerades, vilket tyder på fotobleaching av GFP-tillväxt för olika mätningar. Detta beror på den långsamma diffusionshastigheten i levande celler. Det mellersta diagrammet representerar den gamla korrelationsfunktionen för SOD1.Den grå linjen visar den låga, gamla korrelationsfunktionen. Magentalinjen visar den monterade funktionen. De prickade linjerna anger start- och sluttiderna med montering.Den nedre tabellen visar monterade värden. Här visar vi dig denna procedur för att mäta diffusion från varje cell associerad TDP-25 i cell lysat och allt mutant av SOD1 i levande celler med FCS. Lösliga oligomerer och aggregering i celllyat kan ofta observeras som spikar eller skurar.Å andra sidan, i levande celler observeras sådana spikar sällan, förutom möjligen uppenbara levande strukturer. En långsamt spridande art av mutant SOD1: s lägger till medelljus för enstaka partiklar som SOD1 homopolymerisering inuti för oss. Förfarandet som visas här är enkelt och värdefullt.FCS innehåller ingen strålning;direkt vilande tillstånd. Det är bara din, och vår, fantasi empati.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

Detektion av protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescens komplement (BiFC) analys av protein-protein interaktion i lök celler med Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In vivo Detektion av protein-protein interaktioner på mikro-mönstrade ytor

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Detektering av kväveoxid och superoxidradikalanjonen genom elektronparamagnetisk resonans-spektroskopi från celler med användning av spin traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Detektion av protein interaktioner i Plant använder gateway Kompatibel komplettering Bimolecular Fluorescence (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestämning av lipidaggregat avskärmning av fluorescensmärkt taggade proberna i levande celler genom fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lätt Mätning av diffusionskoefficienter av EGFP-taggade Plasma membranproteiner Använda k-Space Bild korrelationsspektroskopi

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...