Name: detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

A.K., Japonya Bilim Geliştirme Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibesi (C) (#18K06201), Nakatani Yeni Koronavirüs Enfeksiyonlarına Karşı Önlemler Vakfı'ndan hibe, Hokkaido Üniversitesi Gelecekteki Araştırma Liderlerini Geliştirme Ofisi 'nden (L-Station) hibe ve Hoansha Vakfı'ndan bir hibe yardımı ile desteklendi. M. K., "Multimoleküler Kalabalık Biyosistemleri için Kimya" (#20H04686) yenilikçi alanlar üzerine bilimsel araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid ve "Yaşamsal konuların bilgi fiziği" (#20H05522) üzerinde Bilimsel Araştırmalar için JSPS Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklendi.

1. Malzemeler ve reaktifler
<ol><li>Hücre kültürü için pirojenik içermeyen çözümler ve ortam kullanın (Tablo 1).</li>
	<li>Ultra saf su kullanarak biyokimyasal deney için çözümler hazırlayın ve DNase/RNase free olarak kullanın.</li>
	<li>Çok denetim işlemine sahip hücre kültürü için uygun bir FBS seçin. Seçilen FBS lotları düzenli olarak değiştiğinden, FBS için katalog ve lot numarası burada temsil edilemez.</li>
	<li>Plazmid DNA<ol>
<li>eGFP monomer ifadesi için pmeGF...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing.">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li><li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques.">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li><li>Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+with+High+Count+Rate+and+Low-Background+-+Analysis+of+Translational+Diffusion.">Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity.">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230 (2016).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1.">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108 (2), 193-199 (1991).</li><li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state.">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li><li>Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+recognition+state+of+TDP-43+to+single-stranded+DNA+using+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells.">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+example:+shift+of+autocorrelation+curve.">Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li><li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fluorescence+correlation+spectroscopy+setup+and+measurement.">Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li><li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy.">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).</li><li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs.">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li><li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS.">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li><li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation.">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li><li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions.">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li><li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells.">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li></ol>

Ölçümlerden önce sistem kalibrasyonu ile ilgili olarak, numuneyi ölçmek için kullanılanla aynı cam eşyalar kullanılmalıdır (örneğin, hücre lisat için 8 kuyulu kapak cam odası ve canlı hücreler için 35 mm cam taban kabı). Camdaki Rh6G adsorpsiyonu nedeniyle, etkili konsantrasyonu bazen azalabilir. Öyleyse, sadece iğne deliği ayarı için 1 μM gibi yüksek konsantre bir Rh6G çözeltisi kullanılmalıdır. Dedektörü korumak için son derece yüksek foton sayısı oranlarından kaçınılmalıdı...

Amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı gibi nörodejeneratif bozuklukları içeren proteintoplamalarının toksik olduğu ve hücre ve organlarda protein homeostazını (proteostaz) rahatsız edeceği bilinmektedir, bu da yaşlanmaya yol açabilir2. Protein toplamanın temizlenmesi terapötik bir strateji olarak beklenmiştir; bununla birlikte, protein toplama oluşumunu engelleyen ve protein agregalarını bozan kimyasallar (örneğin, küçük moleküller veya ilaçlar) henüz tespit edilmiştir. Ayrıca, protein toplamanın toksisiteyi nasıl uyguladığı zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, protein toplama ile ilgili araştırma projelerini teşvik etmek için, protein toplamayı basitçe tespit etmek için yüksek verim prosedürlerinin getirilmesi önemlidir. Protein toplama ve toplama spesifik floresan boyanın konformasyonunu tanıyan antikorlar kullanılarak protein toplama tespiti yaygın olarak kullanılmıştır3. Bununla birlikte, özellikle bu tür klasik prosedürleri kullanarak canlı hücrelerde toplamayı tespit etmek zordur. 
Förster rezonans enerji transferi (FRET), protein toplama ve yapısal değişimi tespit etmek için yapılan bir prosedürdür. Bununla birlikte, FRET protein dinamiklerini analiz edemez (örneğin, canlı hücrelerde proteinin difüzyonu ve oligomerizasyonu)3. Bu nedenle, burada, tek molekül hassasiyetine sahip floresan moleküllerin difüzyon özelliğini ve parlaklığını ölçen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanarak çözeltideki (örneğin hücre lisat) ve canlı hücreleri tespit etmek için basit bir protokol sunuyoruz4. FCS, lazer tarama konfokal mikroskobu (LSM) kullanılarak yapılan foton sayma yöntemidir. Son derece hassas bir foton dedektörü ve foton varış süresinin otomatik ilişki işlevinin (ACF) hesaplanması kullanılarak, algılama hacmindeki floresan moleküllerin zaman ve parlaklığından geçiş ölçülür. Difüzyon moleküler ağırlığın artmasıyla yavaşlar; bu nedenle, intermoleküler etkileşim FCS kullanılarak tahmin edilebilir. Daha da güçlü bir şekilde, floresan molekülün parlaklığındaki artış moleküllerin homo-oligomerizasyonunu gösterir. Bu nedenle, FCS bu tür protein toplamayı tespit etmek için güçlü bir araçtır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA&#183;4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA)</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>201-16945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic dishes</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm glass base dish</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>3910-035</td>
			<td>For live cell measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm plastic dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum plate</td>
			<td>Bio-Bik</td>
			<td>AB-TC1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td>
			<td>MS-93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm)</td>
			<td>Advantech Toyo</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass chamber 8-wells</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>5232-008</td>
			<td>For solution measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td>basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>biosera</td>
			<td></td>
			<td>Lot check required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM510 META + ConfoCor3</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>FCS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine neuroblastoma Neuro2a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAGGS</td>
			<td>RIKEN</td>
			<td>RDB08938</td>
			<td>Plasmid DNA for the transfection carrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (&#215;100 )</td>
			<td>Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.</td>
			<td>168-23191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-C1-TDP25</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for eGFP monomer expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of protein aggregation using fluorescence correlation spectroscopy

Protein toplama, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) vb. Çözünür veya yaygın protein oligomerlerini veya agregalarını tespit etmek ve analiz etmek için, tek bir molekül hassasiyetine sahip tek bir parçacığın difüzyon hızını ve parlaklığını tespit debilen floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılmıştır. Bununla birlikte, protein toplama tespiti için uygun prosedür ve know-how yaygın olarak paylaşılamamıştır. Burada, hücre lysate ve canlı hücrelerde toplama eğilimli proteinlerin difüzyon özellikleri için fcs ölçümünün standart bir prosedürünü gösteriyoruz: TAR DNA/ RNA bağlayıcı protein 43 kDa (TDP25) ve süperoksit dismutaz 1'in (SOD1) ALS ilişkili 25 kDa karboksil terminal parçası. Temsili sonuçlar, yeşil floresan protein (GFP) etiketli TDP25 agregalarının bir kısmının murine nöroblastom Neuro2a hücre lisatının çözünür kısmına biraz dahil edildiğini göstermektedir. Ayrıca, ALS ile ilişkili mutasyon taşıyan GFP etiketli SOD1 canlı hücrelerde daha yavaş bir difüzyon göstermektedir. Buna göre, burada FCS kullanarak difüzyon özelliği aracılığıyla protein toplamayı tespit etmek için prosedürü tanıtıyoruz.

Canlı hücrelerde hücre lisat ve SOD1-G85R-GFP'de GFP-TDP25 FCS ölçümü yaptık. Her iki durumda da pozitif genlik ve pürüzsüz ACL'ler elde edilebildi. Neuro2a hücrelerinde ifade edilen GFP-TDP25'in bir kısmının çözünür fraksiyonda belirtilen durum altında kurtarıldığini gösterdik6. Hücre lisatının çözünür fraksiyonunda, FCS(Şekil 2A, üst, ok) kullanılarak foton sayım oranı kaydında son derece parlak floresan molekülleri tespit edild...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Burada floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak hücre lisat ve canlı hücrelerde protein oligomerlerini ve toplamayı ölçmek için bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

Floresan korelasyon spektroskopisinin en iyi prensibi olan FCS, başlangıçta 1970'lerde icat edildi. 1990'larda konfokal aparat mikroskopisi ile birleştirilerek FCS için önemli ve birçok iyileştirme kurulmuştur. O zamandan beri FCS, moleküler etkileşimler ve protein toplama analizi gibi birçok kimyasal ve virüs kür uygulaması için kullanılmıştır.Protein toplama nörodejeneratif bozuklukların ayırt edici bir özelliğidir. Floresan parlaklığı, difüzyon özellikleri ile açıklanan moleküler boyutlarda hareket eden tek parçacıklardır. Protein toplamalarının ölçülmesinde çok önemlidir, çünkü moleküllerin öngörülen yaşam döngülerini belirleyebilir, aynı zamanda homo veya hetero polimerizasyonunu ayırt edebilir.Burada, hücre lysates ve canlı hücrelerde FCS kullanarak agrega formu proteini ile ilişkili amyotrofik lateral sklerozun difüzyonunu ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Normal büyüme ortamında rahatça oturarak 100 milimetre plastik tabak büyüyen Neuro2a hücresi hazırlayın. Hücre konfluensi onaylayın.Ortamı çıkarın. Üçüncü kartuş kabına 3,5 mililitre Trypsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Yemeğe 9,5 mililitre normal büyüme ortamı ekleyin ve askıya alın.Hücre süspansiyonu, ölü hücreleri lekelamak için trippan mavisi ile karıştırılır. Hücre sayma slaydına askıya alma ekleyin. Hücre sayacı veya el ile kullanarak hücre sayısını sayın.Canlı cep telefonu numarasını ve canlılıklarını kontrol edin. Sayılan ortamdaki hücreyi mililitre başına 5 gücünde 1.0 kez 10'da seyreltin. Canlı hücre ölçümü için hücre lizisi veya büyüme alanı çanağı için 35 milimetrelik plastik kabın içine iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Yemeği bir gün boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerinin karışımını hazırlayın. Transfeksiyon karışımını hücre sayılan ortama ekleyin ve hücreleri 24 saat kuluçkaya yatırın.Bir gün sonra. Rutin bir mikroskop kullanarak GFP ifadesini denetleyin. Hücrelerdeki çok parlak TDP25 bileşen gövdelerini görebilirsiniz.Hücre lizisi biyokimyasal tezgahta yapılmalıdır. Tabaktaki ortamı çıkarın. Orta olarak yıkamak için 25 santigrat derecede iki mililitre PBS ekleyin.PBS'yi çıkarın. Kabı ezilmiş buzun üstündeki alüminyum bir tabağa yerleştirin. Hemen, 200 mikroliter liziz tamponunu kabın içine ekleyin.Bir hücre kazıyıcı kullanarak yemeği kazıyın. 1,5 milimetrelik yeni bir tüpte çözülmemiş hücre kalıntılarıyla lisatı kurtarın. Lysate'i dört santigrat derecede santrifüjle.Canlı hücre ölçümleri için, ölçümden önce ortamı yenisiyle değiştirin. Faz kontrastı mikroskobu kullanarak hücre ekini kontrol edin. Ayrıca, floresan mikroskobu kullanarak GFP ifadesini kontrol edin.Konfokal mikroskop kombine FCS sistemi kullanın. 488 nanometre lazeri açın. Sistemi en az 30 dakika sabitleyin.Optik yolu kurun. Anlık ışık için 488 nanometre lazer kullanın. Uygun bir ışın ayırıcı ve dikroik sayaç kullanın.Ve ayrıca, floresan sigortaları. Genellikle, kalibrasyon ve çözelti ölçümleri için kapak odalarını kullanacağız. Dikkatlice, kapak odasını alın.Cam yüzeyi lens tarama kağıdına yerleştirin. FCS kalibrasyonunu dökün. Rhodamine 6G çözümünü de ekleyin.Hedefe ultra saf suyu ekleyin. Yağı kullanmayın. Odayı mikroskop aşamasına getirin.Sahneyi uygun konuma getirin. İğne deliği ayarını oluşturun ve iğne deliği ayarlama sihirbazını açın. Foton sayım hızını x yönü için iğne deliğinin kaba hareketi olarak izleyin.En parlak pozisyon haklı olarak belirlendi. Ardından, foton sayım oranını ince hareket olarak izleyin. En parlak konum başarıyla belirlendi Bu x yönü için iğne deliği konumudur.Aynı şekilde, iğne deliğinin en parlak konumunu y yönü için arayın. Y yönü için en parlak konum da başarıyla belirlendi. İğne deliğinin x ve y konumunu birleştirir.Her günün ölçümünden önce iğne deliği konumunu ayarlamak daha iyidir. Canlı yol değiştirildiğinde, iğne deliği konumu yeniden ayarlanmalıdır. Bir sayım oranı oluşturun ve telefon sayım hızını izleyin.BGBM izleme moduna geçin. BGBM değerinin en yüksek olması için çalıştırdığınız nesnenin düzeltme halkasını sayın. Sayım oranı penceresini kapatın.Rhodamine 6G çözüm ölçümü ile başlayın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, Eğri Sığdırma Analizi gerçekleştirmek için sığdır'ı tıklatın. Eski korelasyon işlevinin takılması için bir model seçin.Rhodamine 6G için, üçüz durumda 1 bileşenli, 3 boyutlu difüzyon için modeli seçin. Kırmızı çizgiyi hareket ettirerek montaj başlangıç saatini ayarlayın. Sığdırma hesaplamasını başlatmak için Tüme Sığdır'ı tıklatın.Uyum sapması kontrol edin. Tarafların sıfır civarında deftere nakledilip negatif olduğundan emin olun. Takılan değerleri kontrol edin.Difüzyon süresinin kabaca 20-30 mikrosaniye aralığında olduğundan emin olun. Ayrıca, yapısal parametre dört ila sekizdir. Sığdırma panelini açın ve ölçüm için bir model seçin.Uygun paneldeki numunenin modeline aynı yapısal parametre değerini girin. Türün Sabit olarak ayarlanacağından emin olun. Hücre lisatında GFP-TDP25 ölçümü.Lysate'i kapak odasına yerleştirin. Lisatın kurumasını önlemek için kapağı yerleştirin. Işık gölgelendirmesi için sahne kapağını yerleştirin.Alım panelinde lazer gücünü, ölçüm süresini ve tekrarlarını ayarlayın. Satın almaya başlayın. Bir ani artış gözlendi.Yine bir ani artış gözlendi. Ani artış, algılama gövdesinden geçen parlak molekülleri gösterir. Sivri uçlar çözünür oligomerleri veya agregaları gösterir.Eğri sığdırma analizi yapmak için bir uyum oluşturun. Üçüz durumdaki 2 bileşenli, 3 boyutlu difüzyon için modeli seçin. Uygun başlangıç saatini ayarlayın.Tüme Sığdır'ı tıklatın. Takılan değerleri kontrol edin. CANLı HÜCREDE GFP ölçümü ile etiketlenmiş SOD1-G85R.Çözelti ölçümünün aksine, ısı evresi inkübatörü kullanmanızı öneririm. Mikroskop sahnesinde hücre kültleme kabını ayarlayın. Oküler kullanarak odağı ve konumu onaylayın.Bir ölçüm hücresi seçin. Hızlı tarama modu kullanarak hücre konumunu yakınlaştırın ve ayarlayın. Yavaş tarama hızı modunu kullanarak hücrelerin anlık görüntüsünü alın.Konum aracını kullanarak bir FCS ölçüm pozisyonu seçin. Çapraz çizgi ölçüm pozisyonunu gösterir. Ölçüme başlayın.Foton sayım oranı kaydının hafifçe azalması GFP'nin fotobleaching olduğunu göstermektedir. Eğri montajını gerçekleştirin. Hücre lisatında GFP-TDP25'in temsili sonuçları gösterilmiştir.Üst grafik foton sayım oranının bir kaydı. Okların olduğu yerde çözünür oligomerler ve agregalar öneren bir çivi vardır. Orta grafik eski korelasyon işlevini temsil eder.Gri çizgi düşük, eski korelasyon işlevini gösterir. Macenta çizgisi takılı işlevi gösterir. Noktalı çizgiler, montaj için başlangıç ve bitiş saatlerini gösterir.Alt tabloda takılan değer gösterilir. Daha sonra, canlı bir hücrede SOD1-G85R-GFP'nin temsili sonuçları gösterilir. Üst grafik foton sayım oranımızın bir kaydını temsil eder.Kaydedilen foton sayım oranının kademeli olarak azaldığı gözlendi ve bu da farklı ölçümler için GFP büyümesinin fotobleaching olduğunu düşündürdü. Bunun nedeni canlı hücrelerdeki yavaş difüzyon hızıdır. Orta grafik SOD1'in eski korelasyon işlevini temsil eder.Gri çizgi düşük, eski korelasyon işlevini gösterir. Macenta çizgisi takılan işlevi gösterir. Noktalı çizgiler, montajla başlangıç ve bitiş saatlerini gösterir.Alt tabloda takılı değerler gösterilir. Burada, hücre lisatında TDP-25 ile ilişkili her hücreden ve FCS kullanarak canlı hücrelerde SOD1'in her mutantından difüzyonu ölçmek için bu prosedürü gösteriyoruz. Hücre lisatında çözünür oligomerler ve toplama genellikle sivri uçlar veya patlamalar olarak gözlenebilir.Öte yandan, canlı hücrelerde, muhtemelen bariz canlı yapılar dışında, bu tür sivri uçlar nadiren gözlenir. Mutant SOD1'lerin yavaşça difüze eden bir türü, bizim için içindeki SOD1 homopolimerizasyonu gibi tek parçacıklar için ortalama parlaklık ekler. Burada gösterilen prosedür basit ve değerlidir.FCS radyasyon içermez;doğrudan uyku durumunda. Bu sadece senin ve bizim hayal gücümüz.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Protein Structure

SCIENTISTS IN ACTION

Detection of Protein Ubiquitination

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Helios Gen Tabancası kullanarak Soğan Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) Testi

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Nitrik Oksit ve hücreler arası Elektron Paramanyetik Rezonans Spektroskopisi ile süperoksit Radikal Anyon tespiti Spin Tuzakları kullanarak

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...