Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

البروتين Biomarker الباحث البرمجيات متاحة بحرية (دون أي تكلفة) عن طريق الاتصال كليفتون ك. Fagerquist في clifton.fagerquist@usda.gov. نود أن نعترف بدعم هذا البحث من قبل ARS، وزارة الزراعة الأميركية، منحة CRIS: 2030-42000-051-00-D.

1. إعداد العينة الميكروبيولوجية
<ol><li>تلقيح 25 مل من مرق لوريا (LB) في أنبوب مخروطي 50 مل مع E. coli O113:H21 سلالة RM7788 (أو سلالة بكتيرية أخرى) من مخزون الجلسرين باستخدام حلقة معقمة 1 ميكرولتر. كب الأنبوب وما قبل الثقافة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ساعة.</li>
	<li>Aliquot 100 ميكرولت...

اعتبارات البروتوكول وتتمثل نقاط القوة الرئيسية للبروتوكول الحالي في سرعته وبساطة إعداد العينات واستخدام أداة يسهل تشغيلها نسبيا والتدريب عليها وصيانتها. على الرغم من أن التحليل البروتيوميكي من أسفل إلى أعلى ومن أعلى إلى أسفل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة-ESI-HR-MS موجود في كل م...

يشار إلى تحليل وتحديد البروتينات غير المهضومة عن طريق قياس الطيف الكتلي على أنه التحليل البروتيوميكي من أعلى إلى أسفل1،2،3،4. وهي الآن تقنية راسخة تستخدم تأين الرذاذ الكهربائي (ESI)5 وتحليلات الكتلة عالية الدقة6، وتقنيات التفكك المتطورة ، على سبيل المثال ، فصاب نقل الإلكترون (ETD) ، فصيل التقاط الإلكترون (ECD)7، الفصام فوق البنفسجي للصور (UV-PD)8، إلخ.
تقنية التأين الناعمة الأخرى هي desorption الليزر بمساعدة المصفوفة / التأين (MALDI)9،10،11 التي تم استخدامها على نطاق أقل على نطاق واسع للتحليل من أعلى إلى أسفل ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها تقترن في المقام الأول إلى وقت الطيران (TOF) محللات الكتلة ، والتي لديها دقة محدودة مقارنة مع محللات الكتلة الأخرى. وعلى الرغم من هذه القيود، استغلت أدوات MALDI-TOF وMALDI-TOF-TOF للتحليل السريع من أعلى إلى أسفل للبروتينات النقية والخليط المجزئ وغير المكسر من البروتينات. لتحديد البروتينات النقية، الاضمحلال في المصدر (ISD) هو تقنية مفيدة بشكل خاص لأنه يسمح تحليل الطيف الكتلي (MS) من أيونات شظايا ISD، فضلا عن الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (MS/ MS) من شظايا أيون البروتين توفير جزء تسلسل محدد في كثير من الأحيان من N- و C-termini من البروتين المستهدف، على غرار تسلسل إدمان12،13 . العيب في نهج ISD هو أنه ، كما هو الحال في تسلسل إدمان ، يجب أن تحتوي العينة على بروتين واحد فقط. ويعزى شرط البروتين الوحيد إلى الحاجة إلى إسناد أيونات الشظايا بشكل لا لبس فيه إلى أيونات السلائف. إذا كان هناك اثنين أو أكثر من البروتينات الموجودة في عينة، قد يكون من الصعب تعيين أي أيونات الشظايا تنتمي إلى أي أيونات السلائف.
ويمكن معالجة إسناد أيونات الشظايا/السلائف باستخدام الملدي -TOF-TOF-MS/MS. وكما هو الحال مع أي تجربة كلاسيكية لمرض التصلب العصبي المتعدد/ مرض التصلب العصبي المتعدد، فإن أيونات السلائف يتم اختيارها/عزلها على نطاق واسع قبل التفتت، ويمكن أن تعزى أيونات الشظايا المكتشفة إلى أيون سلائف محدد. ومع ذلك ، تقتصر تقنيات الانفصال المتاحة لهذا النهج على التفكك الناجم عن تصادم الطاقة العالية في المقام الأول (HE-CID)14 أو الاضمحلال بعد المصدر (PSD)15،16. HE-CID و PSD هي الأكثر فعالية في تجزئة الببتيدات والبروتينات الصغيرة، ويمكن أن تكون تغطية التسلسل، في بعض الحالات، محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي PSD في شق العمود الفقري البولي ببتيد (PBC) في المقام الأول على الجانب C-المحطة من بقايا حمض الأسبارتيك والغلوتاميك من قبل ظاهرة تسمى تأثير حمض الأسبارتيك17،18،19،20.
وقد وجدت مالدي-TOF-MS أيضا تطبيق متخصصة في تحديد التصنيف من الكائنات الحية الدقيقة: البكتيريا21، الفطريات22، والفيروسات23. على سبيل المثال، تستخدم أطياف التصلب المتعدد لتحديد البكتيريا غير المعروفة بالمقارنة مع مكتبة مرجعية لأطياف MS للبكتيريا المعروفة باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط للمقارنة. وقد أثبت هذا النهج نجاحا كبيرا بسبب سرعته وبساطته، على الرغم من أنه يتطلب زراعة العزل بين عشية وضحاها. أيونات البروتين التي تم الكشف عنها من خلال هذا النهج (عادة تحت 20 كيلودا) تشمل بصمة MS السماح القرار التصنيفي على مستوى جنس والأنواع وفي بعض الحالات في الأنواع الفرعية24 وسلالة مستوى25،26. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة ليس فقط لتصنيف الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض بشكل تصنيفي فحسب، بل أيضا تحديد عوامل خبيثة محددة، والسموم، وعوامل مقاومة مضادات الميكروبات (AMR). ولتحقيق ذلك، يتم قياس كتلة الببتيدات أو البروتينات أو الجزيئات الصغيرة بالتصلب المتعدد ثم عزلها وتجزئتها بواسطة MS/MS.
البكتيريا المسببة للأمراض غالبا ما تحمل قطع دائرية من الحمض النووي تسمى البلازميدات. البلازميدات، جنبا إلى جنب مع البروبهاج، هي ناقل رئيسي لنقل الجينات الأفقية بين البكتيريا وهي مسؤولة عن الانتشار السريع لمقاومة مضادات الميكروبات وغيرها من عوامل الفوعة عبر البكتيريا. قد تحمل البلازميدات أيضا جينات مضادة للبكتيريا (AB) ، على سبيل المثال ، كوليسين وبكتيريا. عندما يتم التعبير عن هذه الجينات وإفراز البروتينات ، فإنها تعمل على تعطيل آلات ترجمة البروتين من البكتيريا المجاورة التي تحتل نفس المكانة البيئية27. ومع ذلك ، يمكن أن تشكل هذه الإنزيمات المبيدة للبكتيريا خطرا على المضيف الذي أنتجها. ونتيجة لذلك ، يتم التعبير عن الجين من قبل المضيف الذي يمنع على وجه التحديد وظيفة إنزيم AB ويشار إليه باسم بروتين المناعة (Im).
وغالبا ما تستخدم المضادات الحيوية الضارة بالحمض النووي مثل mitomycin-C و ciprofloxacin للحث على استجابة SOS في الإشريكية القولونية المنتجة للسموم في شيغا (STEC) التي يوجد جين سم شيغا(stx) داخل جينوم البروجاب الموجود في الجينوم البكتيري28. لقد استخدمنا التعريفي المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل سابقا للكشف عن وتحديد أنواع Stx والأنواع الفرعية التي تنتجها سلالات STEC29،30،31،32. في العمل السابق، STEC O113:H21 سلالة RM7788 كان مثقف بين عشية وضحاها على وسائل الإعلام أجار تكملها mitomycin-C. ومع ذلك ، بدلا من الكشف عن المتوقع B - subunit من Stx2a في م / ض ~7816 ، تم الكشف عن أيون بروتين مختلف في م / ض ~ 7839 وحددت على أنها بروتين افتراضي بلازميد المشفرة من وظيفة غيرمعروفة 33. في العمل الحالي، حددنا اثنين من البروتينات AB-Im المشفرة بلازميد التي تنتجها هذه السلالة باستخدام تحريض المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل باستخدام برامج مستقلة وضعت لمعالجة ومسح في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم الكامل (WGS). وبالإضافة إلى ذلك، أدرجت إمكانية إدخال تعديلات بعد الترجمة تتضمن اقتطاع التسلسل في البرنامج الحاسوبي. تم تحديد بروتينات المناعة باستخدام هذا البرنامج من الكتلة المقاسة من أيون البروتين الناضج أيونات جزء تسلسل محدد من لجنة البرنامج والميزانية الناجمة عن تأثير حمض الأسبارتيك والكشف عنها من قبل MS / MS-PSD. وأخيرا، تم تحديد مروج المنبع من الجينات AB / ايم في الجينوم البلازميد التي قد تفسر التعبير عن هذه الجينات عندما تتعرض هذه السلالة لمضاد حيوي ضار بالحمض النووي. تم تقديم أجزاء من هذا العمل في الاجتماع الافتراضي للجمعية الكيميائية الأمريكية الوطنية خريف 2020 والمعرض (17-20 أغسطس 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

يحدد هذا البروتوكول بروتينات المناعة للإنزيمات المبيدة للبكتيريا: colicin E3 والبكتيريا ، التي تنتجها سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض باستخدام تحريض المضادات الحيوية ، وتم تحديدها من قبل قياس الطيف الكتلي المترادف MALDI-TOF والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل مع البرامج المطورة داخليا. تم تحديد بروتين المناعة من الكوليسين E3 (Im3) وبروتين المناعة من البكتيريا (Im-Bac) من أيونات جزء بارزة من نوع b و / أو y التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام العمود الفقري للبوليبتيد (PBC) على الجانب C-terminal من حمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك ومخلفات الهليون بواسطة آلية تجزئة تأثير حمض الأسبارتيك. البرنامج بمسح بسرعة في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم كله من سلالة بكتيرية. البرنامج أيضا يزيل تكراريا بقايا الأحماض الأمينية من تسلسل البروتين في حالة أن يتم اقتطاع تسلسل البروتين ناضجة. يمتلك تسلسل بروتين واحد أيونات الكتلة والشظايا بما يتفق مع تلك التي تم اكتشافها لكل بروتين مناعة. ثم تم فحص تسلسل المرشح يدويا للتأكد من إمكانية تعيين جميع أيونات الأجزاء المكتشفة. تمت إزالة ميثيونين N-terminal من Im3 بعد الترجمة ، في حين كان Im-Bac التسلسل الكامل. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن اثنين أو ثلاثة فقط من أيونات الشظايا غير التكميلية التي شكلتها لجنة البرنامج والميزانية ضرورية لتحديد تسلسل البروتين الصحيح. وأخيرا، تم تحديد مروج (صندوق SOS) في المنبع لجينات مضادة للبكتيريا والمناعة في جينوم بلازميد للسلالة البكتيرية.

الشكل 3 (لوحة أعلى) يظهر MS من STEC O113:H21 سلالة RM7788 مثقف بين عشية وضحاها على LBA تكملها مع 400 نانوغرام / مل mitomycin-C. وقد تم تحديد القمم في m/z 7276 و 7337 و 7841 سابقا كبروتين الصدمة الباردة C (CspC) وبروتين الصدمة الباردة E (CspE) وبروتين محمول بلازميد غير معروف الوظيفة ، على التوالي33. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

هنا نقدم بروتوكولا لتحديد سريع للبروتينات التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض تسلسل الجينوم باستخدام MALDI-TOF-TOF قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل مع البرامج التي وضعت في المنزل. أيونات البروتين ميتاستابل جزء بسبب تأثير حمض الأسبارتيك ويتم استغلال هذه خصوصية لتحديد البروتين.

تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في الإشريكية القولونية باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

يوضح البروتوكول طريقة سريعة لتحديد البروتينات البكتيرية باستخدام تحريض المضادات الحيوية وقياس الطيف الكتلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السرعة والبساطة. إعداد العينة غير معقد.يمكن توسيع نطاق هذه التقنية لتشمل توصيف أي بكتيريا مسببة للأمراض ، مثل عوامل الفوعة أو مقاومة المضادات الحيوية لإعلام العلاج المناسب بشكل أفضل للعدوى البكتيرية. للبدء، استخدم حلقة ميكرولتر واحدة معقمة لحصاد البكتيريا من مستعمرات واحدة تزرع على لوحة أغار LB. ونقل إلى اثنين من ملليلتر O-حلقة خط حلقة المسمار غطاء أنبوب الطرد الدقيق التي تحتوي على 300 ميكرولتر من المياه HPLC الصف.ثم دوامة لفترة وجيزة الأنبوب والكريهات الخلايا عن طريق الطرد المركزي، في المياه بقايا 0.75 ميكرولتر من عينة supernatant على الهدف MALDI الفولاذ المقاوم للصدأ، والسماح لها بالجفاف. تراكب بقعة عينة المجففة مع 0.75 ميكرولتر من محلول مشبع من حمض السنابينيك أعدت في 33٪ أسيتونيتريل، 67٪، و 0.2٪ حمض ثلاثي فلوريك، والسماح بقعة لتجف. بمجرد تجفيف البقعة، قم بتحميل الهدف في مطياف الكتلة.افتح برنامج الاستحواذ وانقر فوق اكتساب الوضع الخطي MS أو نطاق الكتلة للشحن والكتلة للشحن من الحدود السفلية والعليا إلى حقولها الخاصة. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على قالب الهدف MALDI. ثم قم باكتئاب زر الماوس الأيسر، واسحب المؤشر فوق عينة الموقع لتحديد المنطقة المستطيلة التي سيتم أخذ عينات منها لإجراء عملية استئصال ليزر أو تأين.حرر زر الماوس لبدء عملية الاستحواذ وجمع 1000 طلقة ليزر لكل بقعة عينة. إذا لم يتم الكشف عن الأيونات زيادة كثافة الليزر عن طريق ضبط شريط مقياس انزلاق تحت كثافة الليزر حتى يتم الكشف عن إشارة أيون البروتين. بعد الانتهاء من اكتساب الوضع الخطي MS، انقر فوق اكتساب وضع انعكاس MS/MS.أدخل كتلة السلائف ليتم تحليلها في حقل كتلة السلائف. بعد ذلك ، أدخل عرض العزلة في دالتون في نافذة كتلة السلائف للجانب الكتلي المنخفض والعالي من كتلة السلائف. انقر فوق الزر إيقاف CID.ثم انقر فوق الزر "مثبط ميتاستابل على". ضبط كثافة الليزر إلى ما لا يقل عن 90٪ من القيمة القصوى عن طريق ضبط شريط مقياس انزلاق كما هو موضح. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على القالب الهدف MALDI، ثم الاكتئاب زر الماوس الأيسر، واسحب المؤشر فوق بقعة عينة لتحديد المنطقة مستطيلة لأخذ عينات من أجل الاستئصال بالليزر أو التأين، والإفراج عن زر الماوس لبدء الاستحواذ وجمع 10،000 طلقات الليزر لكل بقعة عينة كما هو موضح.انقر نقرا مزدوجا فوق ملف "الباحث عن القابل للتنفيذ" للبروتين، وستظهر نافذة واجهة المستخدم الرسومية. أدخل كتلة العلامات الحيوية للبروتين في حقل كتلة البروتين الناضجة، وخطأ قياس الكتلة في مجال التسامح الجماعي. اختياريا، انقر على زر حاسبة كتلة البروتين b/y أيون مجاني لحساب كتلة البروتين من زوج أيون جزء مجاني المفترضة، وسوف تظهر النافذة المنبثقة من أداة حاسبة كتلة البروتين.أدخل نسبة الكتلة إلى الشحن لزوج أيون الشظايا المجاني المفترض، وانقر على زر إضافة زوج، وستظهر كتلة البروتين الحاسبة. نسخ لصق هذه القيمة في حقل الكتلة البروتين ناضجة، وإغلاق نافذة أداة حاسبة كتلة البروتين. انقر على المربع تعيين قيود المخلفات.حدد طول الببتيد إشارة المحطة الطرفية نهاية، والنافذة المنبثقة مع مقياس انزلاق والمؤشر سوف تظهر وتحريك المؤشر إلى طول الببتيد إشارة المطلوبة. إذا لم يتم تحديد طول الببتيد إشارة، سيتم إجراء اقتطاع تسلسل غير مقيد من قبل البرنامج. ضمن شرط أيون جزء، حدد بقايا لانشقاق العمود الفقري Polypeptide عن طريق النقر على مربعات واحد أو أكثر من المخلفات، D-E-N، و / أو P.ثم انقر على إدخال أيونات جزء زائد واحد ليكون زر البحث، وسوف تظهر صفحة جزء المنبثقة.انقر فوق الزر إضافة جزء أيون التالي، وسيظهر حقل منسدل لكل أيون جزء ليتم إدخاله. أدخل الكتلة حسب نسب الشحنة من أيونات الشظايا والكتلة المرتبطة بها عن طريق تحمل الشحنة. ثم انقر على زر حفظ وإغلاق.في المربع الجانبي الأيمن من عدد أيونات الأجزاء التي تحتاج إلى مطابقة ، مرر لتحديد الحد الأدنى لعدد أيونات الأجزاء التي يجب مطابقتها لتحديد الهوية ، وحدد بقايا السيستين في حالتها المؤأكسدة. إذا لم يتم التعرف على البروتينات بعد البحث، كرر البحث مع السيستين في حالتها المخفضة. ضمن إعداد الملف، انقر فوق رمز ملف FASTA حدد لاستعراض وتحديد ملف FASTA يحتوي على تسلسل البروتين في سيليكو من سلالة البكتيرية التي شيدت سابقا.ثم حدد مجلد إخراج ثم قم بإنشاء اسم ملف إخراج. انقر فوق رمز تشغيل البحث على إدخالات الملفات. ستظهر نافذة منبثقة بعنوان تأكيد معلمات البحث التي تعرض معلمات البحث قبل بدء البحث.وإذا كانت معلمات البحث صحيحة، فانقر فوق بدء البحث. إذا كانت المعلمات غير صحيحة، انقر فوق إلغاء الأمر ثم إعادة إدخال المعلمات الصحيحة. بمجرد بدء البحث، سيتم إغلاق إطار المعلمة وستظهر نافذة منبثقة جديدة مع شريط تقدم، تظهر تقدم البحث وعدد الهويات التي تم العثور عليها.عند الانتهاء من البحث، سيتم إغلاق شريط التقدم تلقائيا، وسيتم عرض ملخص للبحث في حقل السجل من واجهة المستخدم الرسومية جنبا إلى جنب مع نافذة منبثقة جديدة تعرض التعرف على البروتين وجدت. في الدراسة الحالية، نمت الثقافات البكتيرية في LB مع تركيزين مختلفين من الوميتوسين-C. الطيف الكتلي للثقافة البكتيرية نمت مع تركيز الوميتوسين-C.تم تحديد بروتين الصدمة الباردة C وبروتين الصدمة الباردة E وبروتين محمول على البلازميد غير معروف الوظيفة. تم تحليل أيون البروتين غير معروف في 9780 من قبل MS / MS، وتم عزل أيون السلائف مع نافذة محدد أيون الوقت من حوالي 100 دالتون. أيون جزء في كتلة لشحن 9675.9 هو امتداد من تفكك أيون البروتين ميتاستابل في 9655.تسلسل بروتين المناعة للكولايسين E3 يحتوي على بقايا أساسية المواقع المحتملة من التأين. أيونات الشظايا التي تم اكتشافها من شق العمود الفقري للبوليبتيد ، عندما تم استخدام الشكل المخفض من السيستين أثناء البحث. تتم إزالة ميثيونين N-المحطة كتعديلات الترجمة آخر.عندما نمت الثقافة البكتيرية بتركيز كبير من الميوميسين-C ، تم تحديد بروتين المناعة للبكتيريا. تم تحليل الذروة غير المعروفة في 9651 من قبل MS / MS ، وتم عزل أيون السلائف مع نافذة TIS أضيق وغير متماثلة من ناقص 75 زائد 60 دالتون. تسلسل بروتين المناعة من البكتيريا يحتوي على المخلفات الأساسية المواقع المحتملة من التأين.أيونات الشظايا التي تم اكتشافها من شق العمود الفقري للبوليبتيد ، عندما تم استخدام الشكل المخفض من السيستين أثناء البحث. مع تركيزات مختلفة من المضادات الحيوية، قد تختلف وفرة البروتين النسبي. وتم تحليل هذه باستخدام قياس الطيف الكتلي.عند حصاد الخلايا البكتيرية، لاحظ مورفولوجيا المستعمرة والنمو البكتيري فيما يتعلق بالمضادات الحيوية والتركيز. حلقة ميكرولتر واحدة من الخلايا ضرورية للكشف عن البروتينات.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

تحديد النوعية من الأحماض الكربوكسيلية، الأحماض Boronic، والأمينات طريق Fluorophores صليبي

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

الاستفادة المثلى من البروتينات التركيبية: تحديد فصل بين التبعيات مبينا هيكليا و / أو بقايا المرتبطة وظيفيا

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

تسلسل مصنع ستريت Heteroxylans عن طريق إنزيمي، والمواد الكيميائية (مثلأيشن) والمادية (الطيف الكتلي، الرنين المغناطيسي النووي) تقنيات

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

سريع سرعة عالية الإنتاجية الأنواع النباتية تحديد المواد عن طريق تحليل المباشر في الوقت الحقيقي عالية الدقة قياس الطيف الكتلي

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

باستخدام شعري الكهربائي لقياس الأحماض العضوية من الأنسجة النباتية: حالة اختبار فحص<em&gt; كافيا ارابيكا</em&gt; بذور

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

في الموقع الكشف والتحديد الكمي خلية مفردة لجسيمات نانوية أكسيد المعدن باستخدام تحليل ميكروبروبي النووية

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع باستخدام المنطقة الشعرية التفريد جنبا إلى جنب الكتلي

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

الإشريكيّة القولونية-"على أساس تخليق البروتين" الخلية الحرة: البروتوكولات لتكنولوجيا منصة قوية ومرنة، وموجودا

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...