Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
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蛋白质生物标志物搜索软件可通过联系 clifton.fagerquist@usda.gov 的Clifton K. Fagerquist免费获得（免费）。我们希望感谢ARS，USDA，CRIS拨款：2030-42000-051-00-D对这项研究的支持。

1. 微生物样品制备
<ol><li>使用无菌的1μL环将25 mL Luria肉汤（LB）接种在50 mL锥形管中，其中含有 大肠杆菌 O113：H21菌株RM7788（或其他细菌菌株）。盖上管子并在37°C下振荡（200rpm）预培养4小时。</li>
	<li>等分100μL预培养的肉汤，并铺展到补充有400或800ng / mL丝裂霉素-C的LB琼脂平板上。将琼脂平板在37°C的培养箱中静态过夜。 注意：STEC菌株是致病微生物。在BSL-2生物安全柜中执行除培养之外...

协议注意事项 当前方案的主要优势是其速度，样品制备的简单性以及使用相对易于操作，训练和维护的仪器。尽管通过液相色谱-ESI-HR-MS进行的自下而上和自上而下的蛋白质组学分析无处不在，并且在许多方面远远优于MALDI-TOF-TOF自上而下的蛋白质组学分析，但它们需要更多的时间，劳动力和专业知识。仪器的复杂性通常会影响某些仪器平台是否有可能被未接受过质谱学正式培训的?...

通过质谱法分析和鉴定未消化的蛋白质被称为自上而下的蛋白质组学分析1，2，3，4。它现在是一种成熟的技术，利用电喷雾电离（ESI）5和高分辨率质量分析仪6，以及复杂的解离技术，例如电子转移解离（ETD），电子捕获解离（ECD）7，紫外线光解离（UV-PD）8等。
另一种软电离技术是基质辅助激光解吸/电离（MALDI）9，10，11，该技术在自上而下分析中的应用较少，部分原因是它主要耦合到飞行时间（TOF）质量分析仪，与其他质量分析仪相比，其分辨率有限。尽管存在这些局限性，但MALDI-TOF和MALDI-TOF-TOF仪器已被用于纯蛋白质以及蛋白质的分馏和普通混合物的快速自上而下分析。对于纯蛋白质的鉴定，源内衰变（ISD）是一种特别有用的技术，因为它允许对ISD片段离子进行质谱（MS）分析，以及蛋白质离子片段的串联质谱（MS / MS），提供通常来自靶蛋白的N-和C-末端的序列特异性片段，类似于Edman测序12，13 .ISD方法的缺点是，与Edman测序一样，样品必须只包含一种蛋白质。一种蛋白质要求是由于需要明确地将片段离子归因于前体离子。如果样品中存在两种或多种蛋白质，则可能很难分配哪些片段离子属于哪些前体离子。
片段离子/前体离子归属可以使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS来解决。与任何经典的MS / MS实验一样，前体离子在碎片化之前被质量选择/分离，检测到的碎片离子可以归因于特定的前体离子。然而，可用于这种方法的解离技术主要限于高能碰撞诱导的解离（HE-CID）14或后源衰变（PSD）15，16。HE-CID和PSD在片段化肽和小蛋白质方面最有效，并且在某些情况下，序列覆盖率可能受到限制。此外，PSD导致多肽骨架裂解（PBC）主要在天冬氨酸和谷氨酸残基的C端侧通过称为天冬氨酸效应的现象17，18，19，20。
MALDI-TOF-MS在微生物分类鉴定中也发现了一个利基应用：细菌21，真菌22和病毒23。例如，MS光谱用于通过使用模式识别算法进行比较的已知细菌的MS光谱参考库来识别未知细菌。这种方法因其速度和简单性而证明非常成功，尽管需要过夜培养分离物。通过这种方法检测到的蛋白质离子（通常低于20 kDa）包括MS指纹，允许在属和物种水平上进行分类分辨率，在某些情况下在亚种24和菌株水平25，26上进行分类分辨率。然而，不仅需要从分类学上对潜在的致病微生物进行分类，还需要确定特定的毒力因子、毒素和抗菌素耐药性（AMR）因子。为了实现这一点，肽，蛋白质或小分子的质量通过MS测量，然后通过MS / MS分离和片段化。
致病细菌通常携带称为质粒的圆形DNA片段。质粒和前噬细胞是细菌之间水平基因转移的主要载体，负责抗菌素耐药性和其他毒力因子在细菌中的快速传播。质粒也可能携带抗菌（AB）基因，例如大肠杆菌素和细菌素。当这些基因被表达并且蛋白质分泌时，它们的作用是禁用占据相同环境生态位的相邻细菌的蛋白质翻译机制27。然而，这些杀菌酶也会对产生它们的宿主构成风险。因此，宿主共表达一个基因，该基因特异性地抑制AB酶的功能，被称为其免疫蛋白（Im）。
破坏DNA的抗生素如丝裂霉素-C和环丙沙星通常用于诱导产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）的SOS反应，其志贺毒素基因（stx）存在于细菌基因组中存在的原噬菌体基因组中28。我们以前使用抗生素诱导，MALDI-TOF-TOF-MS / MS和自上而下的蛋白质组学分析来检测和鉴定STEC菌株29，30，31，32产生的Stx类型和亚型。在之前的工作中，STEC O113：H21菌株RM7788在补充丝裂霉素-C的琼脂培养基上培养过夜。然而，不是在m / z〜7816处检测到Stx2a的预期B亚基，而是在m /z〜7839处检测到不同的蛋白质离子，并将其鉴定为具有未知功能的质粒编码的假设蛋白质33。在目前的工作中，我们鉴定了两种质粒编码的AB-Im蛋白，这些质粒编码的AB-Im蛋白使用抗生素诱导，MALDI-TOF-TOF-MS / MS和自上而下的蛋白质组学分析，使用开发的独立软件处理和扫描来自全基因组测序（WGS）的硅质蛋白序列。此外，该软件还包含了涉及序列截断的翻译后修改（PTM）的可能性。使用该软件从天冬氨酸效应引起的成熟蛋白离子和PBC序列特异性片段离子的测量质量中鉴定免疫蛋白，并通过MS / MS-PSD检测。最后，在质粒基因组中AB / Im基因的上游鉴定出一种启动子，当该菌株暴露于DNA损伤抗生素时，该启动子可以解释这些基因的表达。这项工作的部分内容在美国国家化学学会2020年秋季虚拟会议和博览会（2020年8月17日至20日）上发表34。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

该协议鉴定了杀菌酶的免疫蛋白：大肠杆菌E3和细菌素，由使用抗生素诱导的致病性 大肠杆菌 菌株产生，并通过MALDI-TOF-TOF串联质谱和自上而下的蛋白质组学分析与内部开发的软件进行鉴定。通过天冬氨酸效应片段化机理，从天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺残基C端多肽骨链裂解（PBC）产生的突出的b型和/或y型片段离子中鉴定出绞增素E3（Im3）的免疫蛋白和细菌素（Im-Bac）的免疫蛋白。该软件可快速扫描来自细菌菌株全基因组测序的 硅 质蛋白质序列。该软件还可以在成熟蛋白质序列被截断的情况下迭代删除蛋白质序列的氨基酸残基。单个蛋白质序列具有与每种免疫蛋白检测到的离子一致的质量和片段离子。然后手动检查候选序列，以确认可以分配所有检测到的片段离子。Im3的N端蛋氨酸被翻译后去除，而Im-Bac具有完整的序列。此外，我们发现只有两到三个由PBC形成的非互补片段离子是鉴定正确蛋白质序列所必需的。最后，在细菌菌株的质粒基因组中鉴定出抗菌和免疫基因的上游的启动子（SOS盒）。

图3（顶图）显示了在补充400ng / mL丝裂霉素-C的LBA上培养过夜的STEC O113：H21菌株RM7788的MS。m / z 7276，7337和7841处的峰先前已被鉴定为冷休克蛋白C（CspC），冷休克蛋白E（CspE）和功能未知的质粒传播蛋白，分别为33。通过MS / MS-PSD分析m / z 9780 [M + H]+ 处的蛋白质离子， 如图3 所示（底部面板）。前体离子用定时离子选择器（TIS）窗?...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

在这里，我们提出了一种方案，用于使用MALDI-TOF-TOF串联质谱和自上而下的蛋白质组学分析以及内部开发的软件快速鉴定基因组测序的致病细菌产生的蛋白质。亚稳态蛋白离子片段由于天冬氨酸效应和这种特异性被用于蛋白质鉴定。

使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS和自上而下的蛋白质组学分析鉴定 大肠杆菌 中的抗菌免疫蛋白

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

该协议展示了一种使用抗生素诱导和质谱法快速鉴定细菌蛋白的方法。该技术的主要优点是它的速度和简单性。样品制备简单。该技术可以扩展到任何致病细菌的表征，例如毒力因子或抗生素耐药性，以更好地为细菌感染的适当治疗提供信息。首先，使用无菌的一微升环从LB琼脂平板上生长的单个菌落中收获细菌。并转移到含有300微升HPLC级水的2毫升O形圈环形线螺旋盖微量离心管中。然后短暂涡旋管并通过离心沉淀细胞，在不锈钢MALDI靶标上的样品上清液的0.75微升遗物水中，并使其干燥。用用33%乙腈，67%水和0.2%三氟乙酸制备的0.75微升芥花酸饱和溶液覆盖干燥的样品斑点，并允许斑点干燥。一旦斑点干燥，将目标加载到质谱仪中。打开采集软件，单击MS线性模式采集或质-电荷范围和质量-电荷下限和上限进入各自的场。单击马尔迪目标模板上要分析的样品点。然后按下鼠标左键，将光标拖到样品点上，以指定要为激光烧蚀或电离采样的矩形区域。松开鼠标按钮开始采集，并为每个采样点收集1000张激光照。如果未检测到离子，则通过在激光强度下调整滑动比例尺来增加激光强度，直到检测到蛋白质离子信号。完成MS线性模式采集后，单击MS/MS反射器模式采集。在"前体质量"字段中输入要分析的前体质量。接下来，在"前体质量"窗口中为前体质量的低质量侧和高质量侧输入隔离宽度（以道尔顿为单位）。单击"CID 关闭"按钮。然后单击"亚稳压抑制器打开"按钮。如图所示，通过调整滑动比例尺，将激光强度调整到其最大值的至少90%。在 MALDI 目标模板上单击要分析的样品点，然后按下鼠标左键，将光标拖动到样品点上以指定要采样以进行激光烧蚀或电离的矩形区域，松开鼠标按钮以启动采集，并为每个样品点收集 10， 000 个激光镜头，如图所示。双击蛋白质生物标志物寻求者可执行文件，将出现图形用户界面窗口。在成熟蛋白质质量字段中输入蛋白质生物标志物的质量，在质量耐量字段中输入质量测量误差。或者，单击"免费 b/y 离子蛋白质质量计算器"按钮，从假定的免费片段离子对中计算蛋白质质量，将出现蛋白质质量计算器工具的弹出窗口。输入假定的互补片段离子对的质荷比，单击"添加对"按钮，将出现计算器蛋白质质量。将此值复制粘贴到成熟蛋白质质量字段中，然后关闭蛋白质质量计算器工具窗口。单击"设置残留限制"框。选择终端信号肽长度，将出现带有滑动刻度和光标的弹出窗口，并将光标移动到所需的信号肽长度。如果未选择信号肽长度，则软件将执行无限制的序列截断。在"片段离子条件"下，通过单击一个或多个残基，D-E-N和/或P的框来选择多肽骨架切割的残基，然后单击输入片段离子加一搜索按钮，将出现弹出片段页面。接下来，单击"添加片段离子"按钮，对于要输入的每个片段离子，将出现一个下拉字段。输入碎片离子的质量电荷比及其按电荷容差的相关质量。然后单击"保存并关闭"按钮。在"需要匹配多少个片段离子"的右侧框中，滚动以选择必须匹配以进行鉴定的最小片段离子数，然后选择处于氧化状态的半胱氨酸残基。如果在搜索后未鉴定蛋白质，则用处于还原状态的半胱氨酸重复搜索。在"文件设置"下，单击"选择 FASTA 文件"图标以浏览并选择包含先前构建的细菌菌株的硅蛋白序列的 FASTA 文件。然后选择输出文件夹并创建输出文件名。单击"对文件条目运行搜索"图标。将出现一个标题为"确认搜索参数"的弹出窗口，在启动搜索之前显示搜索参数。如果搜索参数正确，请单击"开始搜索"。如果参数不正确，请单击取消并重新输入正确的参数。启动搜索后，参数窗口将关闭，并显示一个带有进度条的新弹出窗口，显示搜索进度和找到的标识数的运行计数。完成搜索后，进度条将自动关闭，搜索摘要将显示在图形用户界面的日志字段中，并显示一个新的弹出窗口，显示发现的蛋白质鉴定。在目前的研究中，细菌培养物在LB中生长，具有两种不同浓度的霉素-C。细菌培养物的质谱以霉素-C浓度生长。鉴定出冷休克蛋白C、冷休克蛋白E和功能不明的质粒传播蛋白。通过MS/MS分析9780处的未知蛋白离子，并用约100道尔顿的时间离子选择器窗口分离前体离子。质量为9675.9的片段离子是从9655处的亚稳态蛋白离子解离溢出的。用于绞痛素E3的免疫蛋白的序列含有碱性残基可能的电离位点。从多肽主链裂解中检测到的片段离子，当在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时。N端蛋氨酸作为翻译后修饰被移除。当细菌培养物在高菌霉素-C浓度下生长时，鉴定出细菌素的免疫蛋白。通过MS/MS分析了9651处的未知峰，并用零下75加60道尔顿的较窄且不对称的TIS窗口分离了前体离子。细菌素的免疫蛋白序列含有碱性残基可能的电离位点。从多肽主链裂解中检测到的片段离子，当在搜索过程中使用半胱氨酸的还原形式时。随着抗生素浓度的不同，相对蛋白质丰度可能会有所不同。这些是用质谱法分析的。收获细菌细胞时，观察菌落形态和细菌生长与抗生素和浓度的关系。一微升的细胞环对于检测蛋白质是必要的。

Research

JoVE Journal

Chemistry

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