Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
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Le logiciel Protein Biomarker Seeker est disponible gratuitement (sans frais) en contactant Clifton K. Fagerquist à clifton.fagerquist@usda.gov. Nous tenons à reconnaître le soutien de cette recherche par ARS, USDA, bourse CRIS: 2030-42000-051-00-D.

1. Préparation des échantillons microbiologiques
<ol><li>Inoculer 25 mL de bouillon Luria (LB) dans un tube conique de 50 mL avec la souche RM7788 (ou une autre souche bactérienne) d’E. coli O113:H21 provenant d’un stock de glycérol à l’aide d’une boucle stérile de 1 μL. Bouchon du tube et pré-culture à 37 °C en agitant (200 tr/min) pendant 4 h.</li>
	<li>Aliquote 100 μL de bouillon pré-cultivé et étaler sur une plaque de gélose LB complétée par 400 ou 800 ng/mL de mitomycine-C. Plaque...

Considérations relatives au protocole Les principaux points forts du protocole actuel sont sa rapidité, la simplicité de préparation des échantillons et l’utilisation d’un instrument relativement facile à utiliser, à former et à entretenir. Bien que l’analyse protéomique ascendante et descendante par chromatographie liquide-ESI-HR-MS soit omniprésente et de loin supérieure à bien des égards à l’analyse descendante par MALDI-TOF-TOF, elle nécessite plus de temps, de travail et d?...

L’analyse et l’identification des protéines non digérées par spectrométrie de masse sont appelées analyse protéomique descendante1,2,3,4. C’est maintenant une technique établie qui utilise l’ionisation par électropulvérisation (ESI)5 et les analyseurs de masse à haute résolution6,ainsi que des techniques de dissociation sophistiquées, par exemple la dissociation par transfert d’électrons (ETD), la dissociation par capture d’électrons (ECD)7,la photo-dissociation ultraviolette (UV-PD)8,etc.
L’autre technique d’ionisation douce est la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)9,10,11 qui a été moins largement utilisée pour l’analyse descendante, en partie parce qu’elle est principalement couplée à des analyseurs de masse à temps de vol (TOF), qui ont une résolution limitée par rapport aux autres analyseurs de masse. Malgré ces limitations, les instruments MALDI-TOF et MALDI-TOF-TOF ont été exploités pour l’analyse descendante rapide de protéines pures et de mélanges de protéines fractionnés et non fractionnés. Pour l’identification des protéines pures, la désintégration à la source (ISD) est une technique particulièrement utile car elle permet l’analyse par spectrométrie de masse (MS) des ions fragments ISD, ainsi que la spectrométrie de masse en tandem (MS /MS) de fragments d’ions protéiques fournissant un fragment spécifique à la séquence souvent à partir des N- et C-termini de la protéine cible, analogue au séquençage d’Edman12,13 . Un inconvénient de l’approche ISD est que, comme dans le séquençage d’Edman, l’échantillon ne doit contenir qu’une seule protéine. Le seul besoin en protéines est dû à la nécessité d’attribuer sans ambiguïté des ions fragments à un ion précurseur. Si deux protéines ou plus sont présentes dans un échantillon, il peut être difficile d’attribuer quels ions fragments appartiennent à quels ions précurseurs.
L’attribution d’ions fragments/ions précurseurs peut être traitée à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Comme pour toute expérience MS/MS classique, les ions précurseurs sont sélectionnés en masse/isolés avant la fragmentation, et les ions fragments détectés peuvent être attribués à un ion précurseur spécifique. Cependant, les techniques de dissociation disponibles pour cette approche se limitent principalement à la dissociation induite par collision à haute énergie (HE-CID)14 ou à la désintégration post-source (PSD)15,16. HE-CID et PSD sont les plus efficaces pour fragmenter les peptides et les petites protéines, et la couverture de séquence peut, dans certains cas, être limitée. De plus, la DSIP entraîne un clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) principalement du côté C-terminal des résidus d’acide aspartique et glutamique par un phénomène appelé effet acide aspartique17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS a également trouvé une application de niche dans l’identification taxonomique des micro-organismes : bactéries21,champignons22et virus23. Par exemple, les spectres MS sont utilisés pour identifier les bactéries inconnues par rapport à une bibliothèque de référence des spectres MS des bactéries connues à l’aide d’algorithmes de reconnaissance de formes à des fins de comparaison. Cette approche s’est avérée très efficace en raison de sa rapidité et de sa simplicité, bien qu’elle nécessite une culture nocturne de l’isolat. Les ions protéiques détectés par cette approche (généralement inférieurs à 20 kDa) comprennent une empreinte MS permettant une résolution taxonomique au niveau du genre et de l’espèce et dans certains cas au niveau de la sous-espèce24 et de la souche25,26. Cependant, il reste nécessaire non seulement de classer taxonomiquement les micro-organismes potentiellement pathogènes, mais aussi d’identifier des facteurs de virulence, des toxines et des facteurs de résistance aux antimicrobiens (RÉSISTANCE AUX ANTIMICROBIENS) spécifiques. Pour ce faire, la masse de peptides, de protéines ou de petites molécules est mesurée par la SEP, puis isolée et fragmentée par la SEP/SEP.
Les bactéries pathogènes portent souvent des morceaux circulaires d’ADN appelés plasmides. Les plasmides, ainsi que les prophages, sont un vecteur majeur de transfert horizontal de gènes entre les bactéries et sont responsables de la propagation rapide de la résistance aux antimicrobiens et d’autres facteurs de virulence à travers les bactéries. Les plasmides peuvent également être porteurs de gènes antibactériens (AB), par exemple la colicine et la bactériocine. Lorsque ces gènes sont exprimés et que les protéines sont sécrétées, ils agissent pour désactiver la machinerie de traduction des protéines des bactéries voisines occupant la même nicheenvironnementale 27. Cependant, ces enzymes bactéricides peuvent également poser un risque pour l’hôte qui les a produites. En conséquence, un gène est co-exprimé par l’hôte qui inhibe spécifiquement la fonction d’une enzyme AB et est appelé sa protéine d’immunité (Im).
Les antibiotiques endommageant l’ADN tels que la mitomycine-C et la ciprofloxacine sont souvent utilisés pour induire la réponse SOS chez E. coli producteur de toxine Shiga (STEC) dont le gène de la toxine Shiga(stx) se trouve dans un génome de prophage présent dans le génome bactérien28. Nous avons déjà utilisé l’induction antibiotique, MALDI-TOF-TOF-MS/MS et l’analyse protéomique descendante pour détecter et identifier les types et sous-types Stx produits par les souches STEC29,30,31,32. Dans les travaux précédents, la souche RM7788 de STEC O113:H21 a été cultivée pendant la nuit sur un milieu d’agar supplémenté en mitomycine-C. Cependant, au lieu de détecter la sous-unité B anticipée de Stx2a à m/z ~7816, un ion protéique différent a été détecté à m/z ~7839 et identifié comme une protéine hypothétique codée par plasmide de fonction inconnue33. Dans les travaux actuels, nous avons identifié deux protéines AB-Im codées en plasmides produites par cette souche à l’aide de l’induction antibiotique, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, et d’une analyse protéomique descendante à l’aide d’un logiciel autonome développé pour traiter et scanner des séquences de protéines in silico dérivées du séquençage du génome entier (WGS). En outre, la possibilité de modifications post-traduction (PTM) impliquant une troncature de séquence a été intégrée au logiciel. Les protéines immunitaires ont été identifiées à l’aide de ce logiciel à partir de la masse mesurée de l’ion protéique mature et des ions fragments spécifiques à la séquence de la CBP causés par l’effet de l’acide aspartique et détectés par MS/MS-PSD. Enfin, un promoteur a été identifié en amont des gènes AB/Im dans un génome plasmidique qui peut expliquer l’expression de ces gènes lorsque cette souche est exposée à un antibiotique endommageant l’ADN. Des parties de ce travail ont été présentées à la National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 août 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

Ce protocole identifie les protéines immunitaires des enzymes bactéricides : la colicine E3 et la bactériocine, produites par une souche pathogène d’Escherichia coli à l’aide d’une induction antibiotique, et identifiées par spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. La protéine d’immunité de la colicine E3 (Im3) et la protéine d’immunité de la bactériocine (Im-Bac) ont été identifiées à partir d’ions fragments proéminents de type b et/ou y générés par le clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) sur le côté C-terminal de l’acide aspartique, de l’acide glutamique et des résidus d’asparagine par le mécanisme de fragmentation de l’effet de l’acide aspartique. Le logiciel scanne rapidement les séquences protéiques in silico dérivées du séquençage du génome entier de la souche bactérienne. Le logiciel élimine également de manière itérative les résidus d’acides aminés d’une séquence protéique dans le cas où la séquence protéique mature est tronquée. Une seule séquence protéique possédait des ions de masse et de fragment cohérents avec ceux détectés pour chaque protéine d’immunité. La séquence candidate a ensuite été inspectée manuellement pour confirmer que tous les ions fragments détectés pouvaient être attribués. La méthionine N-terminale d’Im3 a été enlevée post-traductionnellement, tandis que Im-Bac avait la séquence complète. De plus, nous avons constaté que seulement deux ou trois ions fragments non complémentaires formés par la CBP sont nécessaires pour identifier la séquence protéique correcte. Enfin, un promoteur (SOS box) a été identifié en amont des gènes antibactériens et immunitaires dans un génome plasmidique de la souche bactérienne.

La figure 3 (panneau supérieur) montre le MS de la souche RM7788 de STEC O113:H21 cultivée pendant la nuit sur LBA supplémenté de 400 ng/mL de mitomycine-C. Les pics à m/z 7276, 7337 et 7841 avaient été identifiés précédemment comme étant la protéine C (CspC) du choc froid, la protéine E (CspE) et une protéine transmise par le plasmide de fonction inconnue, respectivement33. L’ion protéique à m/z 9780 [M+H]+ a été analysé par MS/MS-PSD ...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Nous présentons ici un protocole pour l’identification rapide des protéines produites par des bactéries pathogènes séquencées génomiquement en utilisant la spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF-TOF et l’analyse protéomique descendante avec un logiciel développé en interne. Les ions protéiques métastables se fragmentent en raison de l’effet acide aspartique et cette spécificité est exploitée pour l’identification des protéines.

Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Le protocole démontre une méthode rapide d’identification des protéines bactériennes à l’aide de l’induction antibiotique et de la spectrométrie de masse. Le principal avantage de la technique est sa rapidité et sa simplicité. La préparation des échantillons n’est pas compliquée.La technique peut être étendue à la caractérisation de toute bactérie pathogène, telle que les facteurs de virulence ou la résistance aux antibiotiques pour mieux informer le traitement approprié d’une infection bactérienne. Pour commencer, utilisez une boucle stérile d’un microlitre pour récolter les bactéries de colonies individuelles cultivées sur une plaque de gélose LB. Et transférer dans un tube de microcentrifugeuse à bouchon à vis à joint torique de deux millilitres contenant 300 microlitres d’eau de qualité HPLC.Ensuite, vortexz brièvement le tube et abrasez les cellules par centrifugation, à une eau relique de 0,75 microlitre du surnageant de l’échantillon sur la cible MALDI en acier inoxydable, et laissez-le sécher. Superposer la tache de l’échantillon séché avec 0,75 microlitre d’une solution saturée d’acide sinapinique préparée dans 33% d’acétonitrile, 67% d’eau et 0,2% d’acide trifluoroacétique, et laisser sécher la tache. Une fois la tache séchée, chargez la cible dans le spectromètre de masse.Ouvrez le logiciel d’acquisition et cliquez sur MS Linear Mode Acquisition Ou plage masse-charge et masse-charge des limites inférieure et supérieure dans leurs champs respectifs. Cliquez sur le point d’échantillonnage à analyser sur le modèle de cible MALDI. Appuyez ensuite sur le bouton gauche de la souris et faites glisser le curseur sur le point d’échantillonnage pour spécifier la région rectangulaire à échantillonner pour une ablation ou une ionisation au laser.Relâchez le bouton de la souris pour lancer l’acquisition et collecter 1000 tirs laser pour chaque point d’échantillon. Si les ions ne sont pas détectés, augmentez l’intensité du laser en ajustant la barre d’échelle mobile sous l’intensité du laser jusqu’à ce que le signal d’ions protéiques soit détecté. Une fois l’acquisition du mode linéaire MS terminée, cliquez sur l’acquisition du mode MS/MS Reflectron.Entrez la masse précurseur à analyser dans le champ Masse précurseur. Ensuite, entrez une largeur d’isolement en daltons dans la fenêtre Masse du précurseur pour le côté de masse faible et élevée de la masse du précurseur. Cliquez sur le bouton CID Off.Cliquez ensuite sur le bouton Metastable Suppressor On. Ajustez l’intensité du laser à au moins 90% de sa valeur maximale en ajustant la barre d’échelle mobile comme démontré. Cliquez sur le point d’échantillon à analyser sur le modèle de cible MALDI, puis appuyez sur le bouton gauche de la souris et faites glisser le curseur sur le point d’échantillon pour spécifier la région rectangulaire à échantillonner pour l’ablation laser ou l’ionisation, relâchez le bouton de la souris pour lancer l’acquisition et collectez 10 000 tirs laser pour chaque point d’échantillon comme démontré.Double-cliquez sur le fichier exécutable Protein Biomarker Seeker et la fenêtre de l’interface utilisateur graphique apparaîtra. Entrez la masse du biomarqueur protéique dans le champ Masse protéique mature et l’erreur de mesure de masse dans le champ Tolérance de masse. En option, cliquez sur le bouton Calculateur de masse protéique ionique b /y gratuit pour calculer la masse protéique à partir d’une paire d’ions fragments gratuits putatifs, et la fenêtre contextuelle de l’outil calculateur de masse protéique apparaîtra.Entrez le rapport masse/charge de la paire d’ions fragments gratuits putatifs, cliquez sur le bouton Ajouter une paire et la masse protéique du calculateur apparaîtra. Copiez-collez cette valeur dans le champ Masse protéique mature et fermez la fenêtre de l’outil Calcul de masse protéique. Cliquez sur la case Définir la restriction des résidus.Sélectionnez la longueur peptidique du signal terminal final, et la fenêtre contextuelle avec une échelle mobile et un curseur apparaîtra et déplacera le curseur vers la longueur de peptide de signal souhaitée. Si la longueur du peptide du signal n’est pas sélectionnée, une troncature de séquence sans restriction sera effectuée par le logiciel. Sous la condition d’ion fragment, sélectionnez résidus pour le clivage de l’épine dorsale polypeptidique en cliquant sur les cases d’un ou plusieurs résidus, D-E-N et / ou P.Et puis cliquez sur le bouton Entrer fragment Ions Plus One pour être recherché, et la page de fragment pop-up apparaîtra.Cliquez ensuite sur le bouton Ajouter un fragment d’ion, et un champ déroulant apparaîtra pour chaque ion de fragment à entrer. Entrez les rapports masse par charge des ions fragments et leur tolérance masse par charge associée. Cliquez ensuite sur le bouton Enregistrer et fermer.Dans la zone de droite de Combien d’ions fragments doivent être appariés, faites défiler pour sélectionner le nombre minimum d’ions fragments qui doivent être appariés pour l’identification, et sélectionnez les résidus de cystéine dans leur état oxydé. Si les protéines ne sont pas identifiées après la recherche, répétez la recherche avec des cystéines à l’état réduit. Sous la configuration du fichier, cliquez sur l’icône Sélectionner le fichier FASTA pour parcourir et sélectionner le fichier FASTA contenant les séquences de protéines in silico de la souche bactérienne précédemment construite.Sélectionnez ensuite un dossier de sortie et créez un nom de fichier de sortie. Cliquez sur l’icône Exécuter la recherche sur les entrées de fichier. Une fenêtre contextuelle apparaîtra intitulée Confirmer les paramètres de recherche affichant les paramètres de recherche avant le lancement de la recherche.Et si les paramètres de recherche sont corrects, cliquez sur Commencer la recherche. Si les paramètres sont incorrects, cliquez sur Annuler et entrez à nouveau les paramètres corrects. Une fois la recherche lancée, la fenêtre des paramètres se fermera et une nouvelle fenêtre contextuelle avec une barre de progression apparaîtra, montrant la progression de la recherche et un décompte en cours du nombre d’identifications trouvées.Une fois la recherche terminée, la barre de progression sera fermée automatiquement et un résumé de la recherche sera affiché dans le champ de journal de l’interface utilisateur graphique avec une nouvelle fenêtre contextuelle affichant les identifications de protéines trouvées. Dans la présente étude, des cultures bactériennes ont été cultivées en LB avec deux concentrations différentes de mytomycine-C. Le spectre de masse de la culture bactérienne a grandi avec une concentration de mytomycine-C.La protéine C du choc froid, la protéine E du choc froid et une protéine transmise par le plasmide de fonction inconnue ont été identifiées. L’ion protéique inconnu à 9780 a été analysé par MS / MS, et l’ion précurseur a été isolé avec une fenêtre de sélection d’ions temporels d’environ 100 daltons. L’ion fragment à la masse pour charger 9675,9 est un débordement de la dissociation de l’ion protéine métastable à 9655.La séquence de la protéine d’immunité pour la colicine E3 contient des résidus basiques possibles de sites d’ionisation. Les ions fragments détectés à partir du clivage de l’épine dorsale polypeptidique, lorsque la forme réduite de cystéine a été utilisée pendant la recherche. La méthionine N-terminale est retirée en tant que modification post-traduction.Lorsque la culture bactérienne a été cultivée à une concentration élevée de mytomycine-C, la protéine immunitaire de la bactériocine a été identifiée. Le pic inconnu à 9651 a été analysé par MS/MS, et l’ion précurseur a été isolé avec une fenêtre TIS plus étroite et asymétrique de moins 75 plus 60 daltons. La séquence de la protéine immunitaire de la bactériocine contient des résidus basiques possibles de sites d’ionisation.Les ions fragments détectés à partir du clivage de l’épine dorsale polypeptidique, lorsque la forme réduite de cystéine a été utilisée pendant la recherche. avec les différentes concentrations d’antibiotiques, l’abondance relative des protéines peut varier. Et ceux-ci ont été analysés à l’aide de la spectrométrie de masse.Lors de la récolte de cellules bactériennes, observez la morphologie des colonies et la croissance bactérienne en ce qui concerne les antibiotiques et la concentration. Une boucle d’un microlitre de cellules est nécessaire pour détecter les protéines.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

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