Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

Protein Biomarker Seeker Software ist frei verfügbar (kostenlos) durch Kontaktaufnahme mit Clifton K. Fagerquist unter clifton.fagerquist@usda.gov. Wir möchten die Unterstützung dieser Forschung durch ARS, USDA, CRIS Grant: 2030-42000-051-00-D anerkennen.

1. Mikrobiologische Probenvorbereitung
<ol><li>Impfen Sie 25 ml Luria-Brühe (LB) in einem 50 mL konischen Röhrchen mit E. coli O113:H21-Stamm RM7788 (oder einem anderen Bakterienstamm) aus einem Glycerinvorrat unter Verwendung einer sterilen 1 μL-Schleife. Röhre verschließen und bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min) für 4 h vorkultivieren.</li>
	<li>Aliquot 100 μL vorkultivierte Brühe und auf einer LB-Agarplatte verteilt, ergänzt mit 400 oder 800 ng / ml Mitomycin-C. Agarplatten statisch über Nacht i...

Überlegungen zum Protokoll Die Hauptstärken des aktuellen Protokolls sind seine Geschwindigkeit, die Einfachheit der Probenvorbereitung und die Verwendung eines Instruments, das relativ einfach zu bedienen, zu trainieren und zu warten ist. Obwohl bottom-up- und top-down-Proteomanalyse mittels Flüssigkeitschromatographie-ESI-HR-MS allgegenwärtig und in vielerlei Hinsicht der Top-down-Analyse durch MALDI-TOF-TOF weit überlegen sind, erfordern sie mehr Zeit, Arbeit und Fachwissen. Die Komplexität v...

Die Analyse und Identifizierung unverdauter Proteine mittels Massenspektrometrie wird als Top-down-Proteomanalyse1,2,3,4bezeichnet. Es ist jetzt eine etablierte Technik, die Elektrospray-Ionisation (ESI)5 und hochauflösende Massenanalysatoren6und ausgeklügelte Dissoziationstechniken verwendet, z. B. Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD)7,ultraviolette Photodissoziation (UV-PD)8usw.
Die andere weiche Ionisationstechnik ist die matrixgestützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)9,10,11 ,die für die Top-Down-Analyse weniger umfassend verwendet wurde, zum Teil, weil sie in erster Linie an Time-of-Flight (TOF) Massenanalysatoren gekoppelt ist, die im Vergleich zu anderen Massenanalysatoren eine begrenzte Auflösung haben. Trotz dieser Einschränkungen wurden die Instrumente MALDI-TOF und MALDI-TOF-TOF für die schnelle Top-Down-Analyse von reinen Proteinen und fraktionierten und unfraktionierten Proteinmischungen eingesetzt. Für die Identifizierung reiner Proteine ist der In-Source-Zerfall (ISD) eine besonders nützliche Technik, da sie die massenspektrometrische (MS) Analyse von ISD-Fragmentionen sowie die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) von Proteinionenfragmenten ermöglicht, die sequenzspezifische Fragmente liefern, oft aus den N- und C-Termini des Zielproteins, analog zur Edman-Sequenzierung12,13 . Ein Nachteil des ISD-Ansatzes besteht darin, dass die Probe wie bei der Edman-Sequenzierung nur ein Protein enthalten darf. Die eine Proteinanforderung ist auf die Notwendigkeit einer eindeutigen Zuordnung von Fragmentionen zu einem Vorläuferion zurückzuführen. Wenn zwei oder mehr Proteine in einer Probe vorhanden sind, kann es schwierig sein, zuzuordnen, welche Fragmentionen zu welchen Vorläuferionen gehören.
Fragmention/Vorläufer-Ionen-Attribution kann mit MALDI-TOF-TOF-MS/MS adressiert werden. Wie bei jedem klassischen MS/MS-Experiment werden Vorläuferionen vor der Fragmentierung massenselektiert/isoliert, und die nachgewiesenen Fragmentionen können einem bestimmten Vorläuferion zugeschrieben werden. Die für diesen Ansatz verfügbaren Dissoziationstechniken beschränken sich jedoch auf primär hochenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (HE-CID)14 oder Post-Source-Zerfall (PSD)15,16. HE-CID und PSD sind am effektivsten bei der Fragmentierung von Peptiden und kleinen Proteinen, und die Sequenzabdeckung kann in einigen Fällen begrenzt sein. Darüber hinaus führt PSD zu einer Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) vor allem auf der C-terminalen Seite von Asparagin- und Glutaminsäureresten durch ein Phänomen, das als Asparaginsäureeffekt bezeichnet wird17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS hat auch eine Nischenanwendung bei der taxonomischen Identifizierung von Mikroorganismen gefunden: Bakterien21, Pilze22und Viren23. Zum Beispiel werden MS-Spektren verwendet, um unbekannte Bakterien durch Vergleich mit einer Referenzbibliothek von MS-Spektren bekannter Bakterien unter Verwendung von Mustererkennungsalgorithmen zum Vergleich zu identifizieren. Dieser Ansatz hat sich aufgrund seiner Geschwindigkeit und Einfachheit als sehr erfolgreich erwiesen, obwohl er eine Übernacht-Kultivierung des Isolats erfordert. Die mit diesem Ansatz nachgewiesenen Proteinionen (in der Regel unter 20 kDa) umfassen einen MS-Fingerabdruck, der eine taxonomische Auflösung auf Gattungs- und Artebene und in einigen Fällen auf der Unterart24 und Stammebene25,26ermöglicht. Es besteht jedoch nach wie vor die Notwendigkeit, nicht nur potenziell pathogene Mikroorganismen taxonomisch zu klassifizieren, sondern auch spezifische Virulenzfaktoren, Toxine und Antimikrobielle Resistenzfaktoren (AMR) zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird die Masse von Peptiden, Proteinen oder kleinen Molekülen mittels MS gemessen und anschließend von MS/MS isoliert und fragmentiert.
Pathogene Bakterien tragen oft kreisförmige DNA-Stücke, die Plasmide genannt werden. Plasmide sind zusammen mit Prophagen ein Hauptvektor des horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien und sind für die schnelle Ausbreitung von antibiotikaresistenzen und anderen Virulenzfaktoren über Bakterien verantwortlich. Plasmide können auch antibakterielle (AB) Gene tragen, z. B. Colicin und Bakteriacin. Wenn diese Gene exprimiert und die Proteine sezerniert werden, deaktivieren sie die Proteintranslationsmaschinerie benachbarter Bakterien, die die gleiche Umweltnische besetzen27. Diese bakteriziden Enzyme können jedoch auch ein Risiko für den Wirt darstellen, der sie produziert hat. Folglich wird ein Gen vom Wirt mitexprimiert, das spezifisch die Funktion eines AB-Enzyms hemmt und als sein Immunitätsprotein (Im) bezeichnet wird.
DNA-schädigende Antibiotika wie Mitomycin-C und Ciprofloxacin werden häufig verwendet, um die SOS-Reaktion in Shiga-Toxin-produzierenden E. coli (STEC) zu induzieren, deren Shiga-Toxin-Gen(stx) sich in einem im bakteriellen Genom vorhandenen Prophagengenom befindet28. Wir haben zuvor Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS und Top-Down-Proteomanalyse verwendet, um Stx-Typen und Subtypen zu erkennen und zu identifizieren, die von den STEC-Stämmen29,30,31,32produziert werden. In der vorherigen Arbeit wurde der STEC O113:H21-Stamm RM7788 über Nacht auf Agarmedien kultiviert, die mit Mitomycin-C ergänzt wurden. Anstatt jedoch die erwartete B-Untereinheit von Stx2a bei m/z ~7816 nachzuweisen, wurde bei m/z ~7839 ein anderes Proteinion nachgewiesen und als plasmidkodiertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion33identifiziert. In der aktuellen Arbeit identifizierten wir zwei plasmidkodierte AB-Im-Proteine, die von diesem Stamm mittels Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, und Top-Down-Proteomanalyse mit eigenständiger Software hergestellt wurden, die entwickelt wurde, um in silico Proteinsequenzen zu verarbeiten und zu scannen, die aus der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) abgeleitet wurden. Darüber hinaus wurde die Möglichkeit von Post-Translation-Modifikationen (PTM) mit Sequenzkürzung in die Software integriert. Die Immunitätsproteine wurden mit dieser Software aus der gemessenen Masse des reifen Proteinions und sequenzspezifischen Fragmentionen aus PBC, die durch den Asparaginsäureeffekt verursacht und durch MS/MS-PSD nachgewiesen wurden, identifiziert. Schließlich wurde ein Promotor vor den AB/Im-Genen in einem Plasmidgenom identifiziert, der die Expression dieser Gene erklären könnte, wenn dieser Stamm einem DNA-schädigenden Antibiotikum ausgesetzt ist. Teile dieser Arbeit wurden auf dem National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (August 17-20, 2020)34vorgestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

Dieses Protokoll identifiziert die Immunitätsproteine der bakteriziden Enzyme: Colicin E3 und Bakteriacin, die von einem pathogenen Escherichia coli-Stamm mittels Antibiotika-Induktion produziert und durch MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit selbst entwickelter Software identifiziert wurden. Das Immunitätsprotein von Colicin E3 (Im3) und das Immunitätsprotein von Bakteriacin (Im-Bac) wurden aus prominenten b- und/oder y-Typ-Fragmentionen identifiziert, die durch die Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) auf der C-terminalen Seite von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Asparaginresten durch den Asparaginsäure-Effektfragmentierungsmechanismus erzeugt wurden. Die Software scannt schnell in silico Proteinsequenzen, die aus der gesamten Genomsequenzierung des Bakterienstamms stammen. Die Software entfernt auch iterativ Aminosäurereste einer Proteinsequenz für den Fall, dass die reife Proteinsequenz abgeschnitten wird. Eine einzelne Proteinsequenz besaß Massen- und Fragmentionen, die mit denen übereinstimmten, die für jedes Immunitätsprotein nachgewiesen wurden. Die Kandidatensequenz wurde dann manuell inspiziert, um zu bestätigen, dass alle erkannten Fragmentionen zugeordnet werden konnten. Das N-terminale Methionin von Im3 wurde posttranslational entfernt, während Im-Bac die komplette Sequenz hatte. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nur zwei oder drei nicht-komplementäre Fragmentionen, die durch PBC gebildet werden, notwendig sind, um die richtige Proteinsequenz zu identifizieren. Schließlich wurde ein Promotor (SOS-Box) vor den antibakteriellen und Immunitätsgenen in einem Plasmidgenom des Bakterienstamms identifiziert.

Abbildung 3 (oberes Bild) zeigt die MS des STEC O113:H21-Stammes RM7788, der über Nacht auf LBA mit 400 ng/ml Mitomycin-C kultiviert wurde. Peaks bei m/z 7276, 7337 und 7841 wurden zuvor als Kälteschockprotein C (CspC), Kälteschockprotein E (CspE) und ein plasmidgetragenes Protein unbekannter Funktion identifiziert33. Das Proteinion bei m/z 9780 [M+H]+ wurde mittels MS/MS-PSD analysiert, wie in Abbildung 3 (unteres Bild) dar...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Das Protokoll demonstriert eine schnelle Methode zur Identifizierung bakterieller Proteine mittels Antibiotika-Induktion und Massenspektrometrie. Der Hauptvorteil der Technik ist ihre Geschwindigkeit und Einfachheit. Die Probenvorbereitung ist unkompliziert.Die Technik kann auf die Charakterisierung von pathogenen Bakterien wie Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenz ausgeweitet werden, um eine geeignete Behandlung für eine bakterielle Infektion besser zu informieren. Verwenden Sie zunächst eine sterile Ein-Mikroliter-Schleife, um Bakterien aus einzelnen Kolonien zu ernten, die auf LB-Agarplatte angebaut werden. Und übertragen Sie auf ein zwei Milliliter großes O-Ring-Ring-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 Mikrolitern HPLC-Wasser.Dann das Rohr kurz wirbeln und die Zellen durch Zentrifugation mit einem 0,75 Mikroliter langen Reliktwasser des Probenüberstands auf dem Edelstahl-MALDI-Target entwirren und trocknen lassen. Überlagern Sie den getrockneten Probenfleck mit 0,75 Mikrolitern einer gesättigten Lösung von Sinapinsäure, die in 33% Acetonitril, 67% Wasser und 0,2% Trifluoressigsäure hergestellt wurde, und lassen Sie den Spot trocknen. Sobald der Spot getrocknet ist, laden Sie das Ziel in das Massenspektrometer.Öffnen Sie die Erfassungssoftware und klicken Sie auf MS Linear Mode Acquisition oder Masse-zu-Ladungsbereich und Masse-zu-Ladung der unteren und oberen Grenzen in ihren jeweiligen Feldern. Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot in der MALDI-Zielvorlage. Drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Cursor über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für eine Laserablation oder Ionisation abgetastet werden soll.Lassen Sie die Maustaste los, um die Erfassung zu starten, und sammeln Sie 1000 Laserschüsse für jeden Probenpunkt. Wenn Ionen nicht detektiert werden, erhöhen Sie die Laserintensität, indem Sie den gleitenden Skalenbalken unter Laserintensität einstellen, bis das Proteinionensignal erkannt wird. Klicken Sie nach Abschluss der MS Linear Mode Acquisition auf MS/MS Reflectron Mode Acquisition.Geben Sie die zu analysierende Vorläufermasse in das Feld Vorläufermasse ein. Geben Sie als Nächstes eine Isolationsbreite in Dalton in das Fenster Vorläufermasse für die Seite mit niedriger und hoher Masse der Vorläufermasse ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche CID Aus.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Metastable Suppressor On. Stellen Sie die Laserintensität auf mindestens 90 % ihres Maximalwerts ein, indem Sie die gleitende Skalierungsleiste wie gezeigt anpassen. Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot in der MALDI-Zielvorlage, drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Cursor über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für die Laserablation oder Ionisation abgetastet werden soll, lassen Sie die Maustaste los, um die Erfassung zu initiieren, und sammeln Sie 10.000 Laserschüsse für jeden Probenspot wie gezeigt.Doppelklicken Sie auf die ausführbare Datei Protein Biomarker Seeker und das Fenster mit der grafischen Benutzeroberfläche wird angezeigt. Geben Sie die Masse des Protein-Biomarkers in das Feld Reife Proteinmasse und den Massenmessfehler in das Feld Massentoleranz ein. Klicken Sie optional auf die Schaltfläche Komplementärer b/y-Ionen-Proteinmassenrechner, um die Proteinmasse aus einem vermeintlichen komplementären Fragmentionenpaar zu berechnen, und das Popup-Fenster des Proteinmassenrechner-Tools wird angezeigt.Geben Sie das Masse-Zuladungs-Verhältnis des vermeintlichen komplementären Fragment-Ionenpaares ein, klicken Sie auf die Schaltfläche Paar hinzufügen, und die Rechnerproteinmasse wird angezeigt. Kopieren Sie diesen Wert, fügen Sie diesen Wert in das Feld Mature Protein Mass ein, und schließen Sie das Werkzeugfenster Proteinmassenrechner. Klicken Sie auf das Feld Rückstandsbeschränkung festlegen.Wählen Sie die Endklemmensignal-Peptidlänge, und das Pop-up mit einer gleitenden Skala und einem Cursor erscheint und bewegt den Cursor auf die gewünschte Signalpeptidlänge. Wenn die Signalpeptidlänge nicht ausgewählt ist, wird von der Software eine uneingeschränkte Sequenzkürzung durchgeführt. Wählen Sie unter Fragmentionbedingung die Residues For Polypeptide Backbone Cleavage aus, indem Sie auf die Kästchen eines oder mehrerer Reste, D-E-N und/oder P, klicken Und dann auf die Schaltfläche Enter Fragment Ions Plus One to be search, und die Popup-Fragmentseite wird angezeigt.Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Fragmention hinzufügen, und für jedes ein einzugebende Fragmention erscheint ein Dropdown-Feld. Geben Sie die Masse-durch-Ladungs-Verhältnisse der Fragmentionen und die zugehörige Masse nach Ladungstoleranz ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern und schließen.Scrollen Sie im rechten Seitenfeld von How Many Fragment Ions Need To Be Matched (Wie viele Fragmentionen müssen abgeglichen werden), um die Mindestanzahl von Fragmentionen auszuwählen, die zur Identifizierung abgeglichen werden müssen, und wählen Sie die Cysteinreste in ihrem oxidierten Zustand aus. Wenn die Proteine nach der Suche nicht identifiziert werden, wiederholen Sie die Suche mit Cysteinen in ihrem reduzierten Zustand. Klicken Sie unter Dem Datei-Setup auf das Symbol FASTA-Datei auswählen, um die FASTA-Datei mit den In-silico-Proteinsequenzen des zuvor konstruierten Bakterienstamms zu durchsuchen und auszuwählen.Wählen Sie dann einen Ausgabeordner aus und erstellen Sie einen Ausgabedateinamen. Klicken Sie auf das Symbol Suche nach Dateieinträgen ausführen. Ein Popup-Fenster mit dem Titel Suchparameter bestätigen wird angezeigt, in dem die Suchparameter angezeigt werden, bevor die Suche initiiert wird.Wenn die Suchparameter korrekt sind, klicken Sie auf Suche starten. Wenn die Parameter falsch sind, klicken Sie auf Abbrechen, und geben Sie die richtigen Parameter erneut ein. Sobald die Suche initiiert wurde, wird das Parameterfenster geschlossen und ein neues Popup-Fenster mit einem Fortschrittsbalken wird angezeigt, der den Fortschritt der Suche und eine laufende Zählung der Anzahl der gefundenen Identifikationen anzeigt.Nach Abschluss der Suche wird der Fortschrittsbalken automatisch geschlossen und eine Zusammenfassung der Suche wird im Protokollfeld der grafischen Benutzeroberfläche zusammen mit einem neuen Popup-Fenster angezeigt, in dem die gefundenen Proteinidentifikationen angezeigt werden. In der aktuellen Studie wurden Bakterienkulturen in LB mit zwei verschiedenen Konzentrationen von Mytomycin-C gezüchtet. Das Massenspektrum der Bakterienkultur ist mit einer Mytomycin-C-Konzentration gewachsen.Es wurden Kälteschockprotein C, Kälteschockprotein E und ein durch Plasmid übertragenes Protein unbekannter Funktion identifiziert. Das unbekannte Proteinion bei 9780 wurde von MS / MS analysiert, und das Vorläuferion wurde mit einem Zeitionenselektorfenster von ungefähr 100 Dalton isoliert. Das Fragmention in der Masse, um 9675,9 aufzuladen, ist ein Spillover von der Dissoziation des metastabilen Proteinions bei 9655.Die Sequenz des Immunitätsproteins für Colicin E3 enthält basische Reste möglicher Ionisationsstellen. Die Fragmentionen, die aus der Spaltung des Polypeptid-Rückgrats nachgewiesen wurden, als die reduzierte Form von Cystein während der Suche verwendet wurde. Das N-terminale Methionin wird als Post-Translation-Modifikation entfernt.Wenn die Bakterienkultur bei einer hohen Mytomycin-C-Konzentration gezüchtet wurde, wurde das Immunitätsprotein von Bakteriacin identifiziert. Der unbekannte Peak bei 9651 wurde mittels MS/MS analysiert, und das Vorläuferion wurde mit einem engeren und asymmetrischeren TIS-Fenster von minus 75 plus 60 Dalton isoliert. Die Sequenz des Immunitätsproteins von Bakteriacin enthält basische Rückstände möglicher Ionisationsstellen.Die Fragmentionen, die aus der Spaltung des Polypeptid-Rückgrats nachgewiesen wurden, als die reduzierte Form von Cystein während der Suche verwendet wurde. Mit den unterschiedlichen Konzentrationen von Antibiotika kann die relative Proteinhäufigkeit variieren. Und diese wurden mittels Massenspektrometrie analysiert.Beobachten Sie bei der Ernte von Bakterienzellen die Koloniemorphologie und das Bakterienwachstum in Bezug auf Antibiotika und Konzentration. Eine Ein-Mikroliter-Schleife von Zellen ist notwendig, um Proteine nachzuweisen.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Qualitative Identifizierung von Carbonsäuren, Boronsäuren und Aminen unter Verwendung Cruciform Fluorophore

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Forschung

Chemie

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimierung der synthetische Proteine: Bezeichnung interpositional Abhängigkeiten Anzeige- strukturell und / oder funktionell verknüpft Rückstände

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Schnelle Hochdurchsatz-Spezies Identifizierung von Pflanzen von Material mit Direktanalyse in Echtzeit hochauflösender Massenspektrometrie

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese organischen Säuren aus Pflanzengewebe zu beziffern: ein Test Untersuchen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Saatgut

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-Magnetpartikel verbindlich Analyse durch dynamische und elektrophoretische Lichtstreuung

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...