Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון זמינה באופן חופשי (ללא עלות) על ידי יצירת קשר עם קליפטון ק. פג'רקוויסט בשעה clifton.fagerquist@usda.gov. אנו רוצים להכיר בתמיכה במחקר זה על ידי ARS, USDA, מענק CRIS: 2030-42000-051-00-D.

1. הכנת דגימה מיקרוביולוגית
<ol><li>לחסן 25 מ"ל של מרק לוריא (LB) בצינור חרוט 50 מ"ל עם E. coli O113:H21 זן RM7788 (או זן חיידקי אחר) ממלאי גליצל באמצעות לולאת μL סטרילית. מכסים את הצינור ואת טרום התרבות ב 37 °C (37 °F) עם רועד (200 סל"ד) עבור 4 שעות.</li>
	<li>Aliquot 100 μL של מרק מתורבת מראש להתפשט על צלחת אגר LB בתוספת 400 או 8...

שיקולי פרוטוקול החוזקות העיקריות של הפרוטוקול הנוכחי הן המהירות, הפשטות של הכנת המדגם, ושימוש במכשיר קל יחסית לתפעול, להיות מאומן ולתחזק. למרות שניתוח פרוטאומי מלמטה למעלה ולמעלה למטה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ESI-HR-MS נמצאים בכל מקום ועליונות בהרבה במובנים רבים מלמעלה למטה על יד...

ניתוח וזיהוי של חלבונים לא מעוכאים על ידי ספקטרומטריית מסה מכונה ניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה1,2,3,4. זוהי כעת טכניקה מבוססת המשתמשת יינון אלקטרו-ספריי (ESI)5 ומנתחי מסה ברזולוציה גבוהה6, וטכניקות דיסוציאציה מתוחכמות, למשל, דיסוציאציה להעברת אלקטרונים (ETD), דיסוציאציה לכידת אלקטרונים (ECD)7, דיסוציאציה פוטו-דיסוציאציה אולטרה סגולה (UV-PD)8,וכו '.
טכניקת היוניזציה הרכה האחרת היא desorption/ יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)9,10,11 כי כבר פחות נרחב בשימוש לניתוח מלמעלה למטה, בין היתר משום שהוא מצמיד בעיקר מנתחי מסה זמן טיסה (TOF), אשר יש רזולוציה מוגבלת לעומת מנתחי מסה אחרים. למרות מגבלות אלה, מכשירי MALDI-TOF ו- MALDI-TOF-TOF נוצלו לניתוח מהיר מלמעלה למטה של חלבונים טהורים ותערובות מופרדות ולא מופות של חלבונים. לזיהוי חלבונים טהורים, ריקבון במקור (ISD) היא טכניקה שימושית במיוחד מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) של יונים של שברי ISD, כמו גם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (MS/MS) של שברי יון חלבון המספקים שבר ספציפי לרצף לעתים קרובות מה- N- ו- C-termini של חלבון היעד, בדומה לרצף אדמן12,13 . החיסרון בגישת ISD הוא, כמו ברצף אדמן, המדגם חייב להכיל רק חלבון אחד. דרישת החלבון האחת נובעת מהצורך בייחוס חד משמעי של יונים מקובעים ליון מקדים. אם שני חלבונים או יותר נמצאים במדגם, ייתכן שיהיה קשה להקצות אילו יונים מקדים שייכים לאיזה יונים קודמים.
ניתן לטפל בייחוס יון יון/מבשר באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS. כמו בכל ניסוי קלאסי של MS/MS, יונים קודמים נבחרים/מבודדים במסה לפני הפיצול, וניתן לייחס את יונים השברים שזוהו ליון מקדים ספציפי. עם זאת, טכניקות הניתוק הזמינות לגישה זו מוגבלות בעיקר לניתוק המושרה בהתנגשות אנרגיה גבוהה (HE-CID)14 או ריקבון לאחר המקור (PSD)15,16. HE-CID ו PSD הם היעילים ביותר בפיצול פפטידים וחלבונים קטנים, ואת כיסוי הרצף יכול, במקרים מסוימים, להיות מוגבל. בנוסף, PSD תוצאות מחשוף עמוד השדרה פוליפפטיד (PBC) בעיקר בצד C-מסוף של שאריות חומצה אספרטית וגלוטמית על ידי תופעה הנקראת אפקט חומצה אספרטית17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS מצא גם יישום נישה בזיהוי טקסונומי של מיקרואורגניזמים: חיידקים21, פטריות22, ווירוסים23. לדוגמה, ספקטרום MS משמש לזיהוי חיידקים לא ידועים בהשוואה לספריית ייחוס של ספקטרום MS של חיידקים ידועים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי דפוסים לשם השוואה. גישה זו הוכיחה את עצמה כמוצלחת מאוד בגלל המהירות והפשטות שלה, אם כי דורשת פולחן בן לילה של הבידוד. יונים חלבון שזוהו על ידי גישה זו (בדרך כלל תחת 20 kDa) מורכב טביעת אצבע MS המאפשר רזולוציה טקסונומית ברמת הסוג והמינים ובמקרים מסוימים בתת מינים24 ורמתזן 25,26. עם זאת, עדיין יש צורך לא רק לסווג טקסונומית מיקרואורגניזמים פתוגניים, אלא גם לזהות גורמי וירוליציה ספציפיים, רעלים, וגורמי התנגדות מיקרוביאלית (AMR). כדי להשיג זאת, המסה של פפטידים, חלבונים, או מולקולות קטנות נמדדים על ידי MS ולאחר מכן מבודדים ומפוצלים על ידי MS / MS.
חיידקים פתוגניים נושאים לעתים קרובות חתיכות עגולות של DNA הנקראות פלסמידים. פלסמידים, יחד עם פרופג'ים, הם וקטור מרכזי של העברת גנים אופקית בין חיידקים ואחראים להתפשטות המהירה של עמידות מיקרוביאלית וגורמי אלימות אחרים על פני חיידקים. פלסמידים עשויים גם לשאת גנים אנטיבקטריאליים (AB), למשל, קוליצין ובקטריוצין. כאשר גנים אלה באים לידי ביטוי והחלבונים מופרשים, הם פועלים כדי להשבית את מכונות תרגום החלבון של חיידקים שכנים הכובשים את אותה נישה סביבתית27. עם זאת, אנזימים חיידקיים אלה יכולים גם להוות סיכון לפונדקאי שייצר אותם. כתוצאה מכך, גן מתבטא במשותף על ידי המארח המעכב באופן ספציפי את תפקודו של אנזים AB ומכונה חלבון החסינות שלו (Im).
אנטיביוטיקה מזיקה לדנ"א כגון mitomycin-C וציפרופלוקסצין משמשות לעתים קרובות כדי לגרום לתגובת SOS ב- E. coli המייצר רעלן Shiga (STEC) שהגן שלו רעלן שיגה(STX) נמצא בתוך גנום פרופג 'הנמצא בגנום החיידקי28. השתמשנו באינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה בעבר כדי לזהות ולזהות סוגי Stx וסוגי משנה המיוצרים על ידי זני STEC29,30,31,32. בעבודה הקודמת, STEC O113:H21 זן RM7788 היה תרבותי בן לילה על תקשורת אגר בתוספת mitomycin-C. עם זאת, במקום לזהות את B-subunit הצפוי של Stx2a ב m / z ~7816, יון חלבון שונה זוהה ב m / z ~ 7839 וזוהה כחלבון היפותטי מקודד פלסמיד של פונקציה לא ידועה33. בעבודה הנוכחית, זיהינו שני חלבוני AB-Im מקודדים פלסמיד המיוצרים על ידי זן זה באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה באמצעות תוכנה עצמאית שפותחה לעיבוד וסריקה ברצפי חלבון סיליקו המופקים מרצף גנום שלם (WGS). בנוסף, האפשרות של שינויים לאחר התרגום (PTM) מעורבים truncation רצף שולבו בתוכנה. חלבוני החסינות זוהו באמצעות תוכנה זו מהמסה הנמדדת של יון החלבון הבוגר ויוני שבר ספציפיים לרצף מ- PBC שנגרמו על ידי אפקט החומצה אספרטית וזוהו על ידי MS/ MS-PSD. לבסוף, מקדם זוהה במעלה הזרם של הגנים AB / Im בגנום plasmid שעשוי להסביר את הביטוי של גנים אלה כאשר זן זה נחשף לאנטיביוטיקה מזיקה ל- DNA. חלקים מעבודה זו הוצגו בכנס הווירטואלי של האגודה האמריקנית הלאומית לכימיה בסתיו 2020 (17-20 באוגוסט 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

פרוטוקול זה מזהה את חלבוני החסינות של אנזימי החיידקים: קוליצין E3 ובקטריוצין, המיוצר על ידי זן Escherichia coli פתוגניים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה דו-מושבית MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. חלבון החסינות של קוליצין E3 (Im3) וחלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) זוהו מיונים בולטים מסוג b ו/או y שנוצרו על ידי מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC) בצד ה- C-מסוף של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית ושאריות אספרגין על ידי מנגנון הפיצול של אפקט חומצה אספרטית. התוכנה סורקת במהירות רצפי חלבון סיליקו שמקורם ברצף הגנום כולו של זן החיידקים. התוכנה גם מסירה באופן איטרטיבי שאריות חומצת אמינו של רצף חלבון במקרה שרצף החלבון הבוגר נחתך. רצף חלבונים יחיד היה בעל מסה ורסיסים בקנה אחד עם אלה שזוהו עבור כל חלבון חסינות. לאחר מכן נבדק רצף המועמדים באופן ידני כדי לאשר שניתן להקצות את כל יונים הרסיסים שזוהו. המתיונין N-terminal של Im3 הוסר לאחר התרגום, ואילו לאים-באק היה את הרצף המלא. בנוסף, מצאנו כי רק שניים או שלושה יונים שבר לא משלימים שנוצרו על ידי PBC נחוצים כדי לזהות את רצף החלבון הנכון. לבסוף, מקדם (תיבת SOS) זוהה במעלה הזרם של הגנים האנטיבקטריאליים והחסינות בגנום פלסמיד של זן החיידקים.

איור 3 (פאנל עליון) מציג את MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 400 ng / mL mitomycin-C. פסגות ב m/ z 7276, 7337, ו 7841 זוהו בעבר כמו חלבון הלם קר C (CspC), חלבון הלם קר E (CspE), וחלבון נישא פלסמיד של פונקציה לא ידועה, בהתאמה33. יון החלבון ב-m/z 9780 [M+H]+ נותח על-ידי MS/MS-PSD כפי שמוצג ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה לזיהוי חלבונים חיידקיים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית וספקטרומטריית מסה. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא מהירות ופשטות. הכנת מדגם אינה מסובכת.הטכניקה יכולה להיות מורחבת לאפיון של כל חיידקים פתוגניים, כגון גורמי ארס או עמידות לאנטיביוטיקה כדי ליידע טוב יותר טיפול מתאים לזיהום חיידקי. כדי להתחיל, השתמש בלולאת מיקרוליטר סטרילית אחת כדי לקצור חיידקים ממושבות בודדות הגדלות על צלחת אגר LB. ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה עם 2 מיליליטר עם מכסה בורג המכיל 300 מיקרוליטרים של מים באיכות HPLC.לאחר מכן מערבולת לזמן קצר את הצינור ואת הכדור את התאים על ידי צנטריפוגה, ב 0.75 מיקרוליטר שריד מים של supernatant מדגם על יעד MALDI נירוסטה, ולאפשר לו להתייבש. לכסות את נקודת המדגם המיובשת עם 0.75 microliters של פתרון רווי של חומצה סינפינית מוכן 33%acetonitrile, 67%מים, ו 0.2% חומצה טריפלואורואצטית, ולאפשר את המקום להתייבש. ברגע שהנקודה מתייבשת, טען את המטרה בספקטרומטר המסה.פתח את תוכנת הרכישה ולחץ על רכישת מצב ליניארי של MS או על טווח טעינה המונית ונפח לטעינה המונית של הגבולות התחתונים והעליון לשדות המתאימים שלהם. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI. לאחר מכן הלחצו את לחצן העכבר השמאלי וגררו את הסמן מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה או יינון בלייזר.שחרר את לחצן העכבר כדי ליזום את הרכישה ולאסוף 1000 צילומי לייזר עבור כל נקודה לדוגמה. אם יונים אינם מזוהים להגדיל את עוצמת הלייזר על ידי התאמת סרגל סולם הזזה תחת עוצמת לייזר עד אות יון חלבון מזוהה. לאחר השלמת רכישת מצב ליניארי של MS, לחץ על רכישת מצב רפלקטורון MS/MS.הזן את מסת המבשר שיש לנתח בשדה מסה מבשר. לאחר מכן, הזן רוחב בידוד בדלטון בחלון המסה של הקדמה עבור הצד המסה הנמוכה והגבוהה של המסה המבשרת. לחץ על לחצן כיבוי CID.לאחר מכן לחץ על לחצן מדכא Metastable בהפעלה. התאם את עוצמת הלייזר ל-90% לפחות מהערך המרבי שלו על-ידי התאמת סרגל קנה המידה של ההזזה כפי שהודגם. לחץ על הנקודה לדוגמה שיש לנתח בתבנית היעד של MALDI, ולאחר מכן לחץ על לחצן העכבר השמאלי וגרור את הסמן מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה או יינון בלייזר, שחרר את לחצן העכבר כדי ליזום את הרכישה ולאסוף 10, 000 צילומי לייזר עבור כל נקודה לדוגמה כפי שהודגם.לחץ פעמיים על קובץ ההפעלה של מחפש הסמן הביולוגי של חלבון, וחלון ממשק המשתמש הגרפי יופיע. הזן את המסה של הסמן הביולוגי של החלבון בשדה מסת חלבון בוגר, ואת שגיאת מדידת המסה בשדה סובלנות המונית. לחלופין, לחצו על כפתור מחשבון מסת חלבון החלבון המשלים b/y כדי לחשב את מסת החלבון מזוג יונים של שברים משלימים, והחלון הנפתח של כלי מחשבון מסת החלבון יופיע.הזינו את יחס המסה לטעינה של זוג היונים של שברים משלימים, לחצו על הכפתור 'הוסף זוג' ומסת חלבון מחשבון תופיע. העתק הדבק ערך זה בשדה מסת חלבון בוגרת וסגור את חלון הכלי מחשבון מסת חלבון. לחץ על התיבה הגדר הגבלת שאריות.בחר את אורך הפפטיד של אות מסוף הסיום, והחלון המוקפץ עם קנה מידה הזזה והסמן יופיע ויזיז את הסמן לאורך הפפטיד הרצוי. אם אורך הפפטיד של האות לא נבחר, תבוצע רצף בלתי מוגבל על-ידי התוכנה. תחת מצב יון קטע, בחר את שאריות עבור מחשוף עמוד השדרה של פוליפפטיד על-ידי לחיצה על התיבות של שאריות אחת או יותר, D-E-N ו/או P.ולאחר מכן לחץ על לחצן הזן יונים מקטעים פלוס אחד לחיפוש, ודף הקטע המוקפץ יופיע.לחיצה נוספת על לחצן הוסף יון קטע, ושדה נפתח יופיע עבור כל יון קטעים להזנה. הזן את המסה לפי יחסי טעינה של יונים שבר והמסה המשויכת שלהם על ידי עמידות מטען. לאחר מכן לחץ על לחצן שמור וסגור.בתיבה השמאלית של כמה שברים יונים צריך להיות תואם, גלול כדי לבחור את המספר המינימלי של יונים שבר שיש להתאים לזיהוי, ובחר את שאריות ציסטאין במצבם החמומצן. אם החלבונים אינם מזוהים לאחר החיפוש, חזור על החיפוש עם cysteines במצבם המופחת. תחת הגדרת הקובץ, לחץ על סמל קובץ SELECT FASTA כדי לעיין ולבחור את קובץ FASTA המכיל את רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים שנבנה בעבר.לאחר מכן בחר תיקיית פלט וצור שם קובץ פלט. לחץ על הסמל הפעל חיפוש בערכי קבצים. יופיע חלון מוקפץ שכותרתו אישור פרמטרי חיפוש המציגים את פרמטרי החיפוש לפני תחילת החיפוש.ואם פרמטרי החיפוש נכונים, לחץ על התחל חיפוש. אם הפרמטרים שגויים, לחץ על ביטול והזן מחדש את הפרמטרים הנכונים. לאחר תחילת החיפוש, חלון הפרמטר ייסגר ויופיע חלון מוקפץ חדש עם מד התקדמות, המציג את התקדמות החיפוש וספירה רצה של מספר הזיהויים שנמצאו.עם השלמת החיפוש, מד ההתקדמות ייסגר באופן אוטומטי, וסיכום החיפוש יוצג בשדה יומן הרישום של ממשק המשתמש הגרפי יחד עם חלון מוקפץ חדש המציג את זיהויי החלבון שנמצאו. במחקר הנוכחי, תרביות חיידקים גדלו LB עם שני ריכוזים שונים של mytomycin-C. הספקטרום ההמוני של תרבית החיידקים גדל עם ריכוז מיטומיצין-C.חלבון הלם קר C, חלבון הלם קר E, וחלבון נישא פלסמיד של תפקוד לא ידוע זוהו. יון החלבון הלא ידוע ב-9780 נותח על ידי טרשת נפוצה, והיון המבשר היה מבודד עם חלון בורר יונים של כ-100 דלטון. יון השבר במסה לטעון 9675.9 הוא שפיכה מן הניתוק של יון חלבון metastable ב 9655.הרצף של חלבון החסינות עבור קולצין E3 מכיל שאריות בסיסיות אתרים אפשריים של יינון. יונים שבר זוהה מ מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד, כאשר הצורה המופחתת של ציסטאין שימשה במהלך החיפוש. מת'ionine N-מסוף מוסר כשינוי תרגום לאחר.כאשר התרבות החיידקית גדלה בריכוז מיטומיצין-C גבוה, זוהה חלבון החסינות של הבקטריוצין. השיא הלא ידוע ב-9651 נותח על ידי MS/MS, והיון הקדמון היה מבודד עם חלון TIS צר יותר ואסימטרי של מינוס 75 ועוד 60 דלטון. רצף חלבון החסינות של בקטריוצין מכיל שאריות בסיסיות אתרים אפשריים של יינון.יונים שבר זוהה מ מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד, כאשר הצורה המופחתת של ציסטאין שימשה במהלך החיפוש. עם הריכוזים השונים של אנטיביוטיקה, שפע חלבון יחסי עשוי להשתנות. ואלה נותחו באמצעות ספקטרומטריית מסה.בעת קצירת תאים חיידקיים, התבונן במורפולוגיה של המושבה ובצמיחה חיידקית ביחס לאנטיביוטיקה וריכוז. לולאת מיקרוליטר אחת של תאים נחוצה כדי לזהות חלבונים.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

זיהוי איכותי של חומצות קרבוקסיליות, חומצות boronic, ואמיני שימוש fluorophores הצלב

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

ושאריות או זיהוי של Interpositional תלות המציין מבני / צמודות תפקודית: אופטימיזציה של חלבונים סינטטיים

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

באמצעות אלקטרופורזה נימים לכמת חומצות אורגניות מרקמות צמח: מקרה מבחן בחינה<em&gt; קפה ערביקה</em&gt; זרעים

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

בחיי עיר זיהוי, כימות תא בודד של תחמוצת מתכת חלקיקים באמצעות ניתוח Microprobe גרעיני

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

חלקיקים מגנטיים-DNA מחייב ניתוח לפי פיזור אור דינאמי, Electrophoretic

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-המבוסס על סינתזת החלבון ללא תא: פרוטוקולים עבור טכנולוגיית פלטפורמה חזקים, גמישים ונגישים

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...