Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
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प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर clifton.fagerquist@usda.gov में क्लिफ्टन के Fagerquist से संपर्क करके स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है (कोई कीमत पर) । हम एआरएस, यूएसडीए, क्रिस ग्रांट द्वारा इस शोध के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: 2030-42000-051-00-डी।

1. माइक्रोबायोलॉजिकल नमूना तैयार
<ol><li>ई. कोलाई O113 के साथ एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में लुरिया शोरबा (एलबी) के 25 एमएल टीका: H21 तनाव RM7788 (या एक और जीवाणु तनाव) एक बाँझ 1 μL पाश का उपयोग कर एक ग्लिसरोल स्टॉक से। 4 घंटे क?...

प्रोटोकॉल विचार वर्तमान प्रोटोकॉल की प्राथमिक ताकत इसकी गति, नमूना तैयारी की सादगी, और एक उपकरण का उपयोग है जो संचालित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, पर प्रशिक्षित किया जाना है, और बनाए रखना है?...

बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अपाच्य प्रोटीन का विश्लेषण और पहचान को ऊपर- नीचे प्रोटेओमिक विश्लेषण 1 ,2,3, 4के रूप में जानाजाताहै। अब यह एक स्थापित तकनीक है जो इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई)5 और उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास एनालाइजर6,और परिष्कृत वियोजन तकनीकों, जैसे, इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण वियोजन (ईटीडी), इलेक्ट्रॉन कैप्चर वियोजन (ईसीडी)7,पराबैंगनी फोटो-वियोजन (यूवी-पीडी)8,आदि का उपयोग करती है।
अन्य सॉफ्ट आयनाइजेशन तकनीक मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्पशन/आयनीकरण (MALDI)9,10,11 है जिसका ऊपर-डाउन विश्लेषण के लिए कम बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, क्योंकि यह मुख्य रूप से समय-उड़ान (टीएफए) मास एनालाइजर के साथ मिलकर होता है, जिसमें अन्य मास एनालाइजर की तुलना में सीमित संकल्प होता है। इन सीमाओं के बावजूद, शुद्ध प्रोटीन और प्रोटीन के आंशिक और बिना उल्लंघन के मिश्रण के तेजी से ऊपर-नीचे विश्लेषण के लिए मालदी-टीईएफ और मालडी-टीईएफ-टीईएफ उपकरणों का दोहन किया गया है । शुद्ध प्रोटीन की पहचान के लिए, इन-सोर्स क्षय (आईएसडी) एक विशेष रूप से उपयोगी तकनीक है क्योंकि यह आईएसडी टुकड़े आयनों के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण की अनुमति देता है, साथ ही प्रोटीन आयन टुकड़ों के साथ मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) अक्सर एन-और सी-टर्मिनी से लक्ष्य प्रोटीन के अनुक्रम-विशिष्ट टुकड़े प्रदान करता है, एडमैन अनुक्रमण के अनुरूप12,13 . आईएसडी दृष्टिकोण के लिए एक दोष यह है कि, एडमैन अनुक्रमण के रूप में, नमूने में केवल एक प्रोटीन होना चाहिए। एक प्रोटीन की आवश्यकता एक अग्रदूत आयन के लिए टुकड़े आयनों के स्पष्ट रोपण की आवश्यकता के कारण है। यदि एक नमूने में दो या अधिक प्रोटीन मौजूद हैं, तो यह बताना मुश्किल हो सकता है कि कौन से टुकड़े आयन किस अग्रदूत आयनों से संबंधित हैं।
खंड आयन/अग्रदूत आयन एट्रिब्यूशन को मालदी-TOF-TOF-MS/MS का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है । किसी भी शास्त्रीय एमएस/एमएस प्रयोग के साथ के रूप में, अग्रदूत आयनों बड़े पैमाने पर चयनित/विखंडन से पहले अलग कर रहे हैं, और पता चला खंड आयनों एक विशिष्ट अग्रदूत आयन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए उपलब्ध वियोजन तकनीकों को मुख्य रूप से उच्च ऊर्जा टकराव-प्रेरित वियोजन (एचई-सीआईडी)14 या पोस्ट-सोर्स क्षय (पीएसडी)15, 16तक सीमित कियागयाहै। वह-सीआईडी और पीएसडी पेप्टाइड्स और छोटे प्रोटीन को खंडित करने में सबसे प्रभावी हैं, और अनुक्रम कवरेज, कुछ मामलों में, सीमित हो सकता है । इसके अलावा, पीएसडी के परिणामस्वरूप मुख्य रूप से एस्पार्टिक और ग्लूटामिक एसिड अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड पर एस्पेटिक एसिड प्रभाव17, 18, 19, 20नामक घटना के सी-टर्मिनल पर पॉलीपेप्टाइड बैकबोन क्लीवेज (पीबीसी)होताहै।
माल्डी-टोफ-एमएस ने सूक्ष्मजीवों की वर्गीकरण पहचान में एक आला आवेदन भी पाया है: बैक्टीरिया21,कवक22,और वायरस23। उदाहरण के लिए, एमएस स्पेक्ट्रा का उपयोग तुलना के लिए पैटर्न मान्यता एल्गोरिदम का उपयोग करके ज्ञात बैक्टीरिया के एमएस स्पेक्ट्रा के संदर्भ पुस्तकालय की तुलना में अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए किया जाता है। यह दृष्टिकोण अपनी गति और सादगी के कारण अत्यधिक सफल साबित हुआ है, हालांकि अलग-थलग होने की रात भर खेती की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण (आमतौर पर 20 केडीए के तहत) द्वारा पता लगाए गए प्रोटीन आयनों में एक एमएस फिंगरप्रिंट शामिल है जो जीनस और प्रजातियों के स्तर पर वर्गीकरण संकल्प की अनुमति देता है और कुछ मामलों में उप-प्रजातियों24 और तनाव स्तर25,26पर है। हालांकि, न केवल संभावित रोगजनक सूक्ष्मजीवों को वर्गीकरण करने की आवश्यकता है बल्कि विशिष्ट उग्रता कारकों, विषाक्त पदार्थों और रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) कारकों की पहचान भी की गई है। इसे पूरा करने के लिए पेप्टाइड्स, प्रोटीन या छोटे अणुओं के द्रव्यमान को एमएस द्वारा मापा जाता है और बाद में एमएस/एमएस द्वारा अलग और खंडित किया जाता है ।
रोगजनक बैक्टीरिया अक्सर प्लाज्मिड नामक डीएनए के परिपत्र टुकड़े ले जाते हैं। प्लास्मिड्स, प्रोफैग्स के साथ, बैक्टीरिया के बीच क्षैतिज जीन हस्तांतरण का एक प्रमुख वेक्टर हैं और बैक्टीरिया में एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध और अन्य उग्रता कारकों के तेजी से फैलने के लिए जिम्मेदार हैं। प्लाज्मिड्स में एंटीबैक्टीरियल (एबी) जीन भी हो सकते हैं, जैसे, कोलिसिन और बैक्टीरियोसिन। जब इन जीनों को व्यक्त किया जाता है और प्रोटीन स्रावित होते हैं, तो वे पड़ोसी बैक्टीरिया की प्रोटीन अनुवाद मशीनरी को निष्क्रिय करने का कार्य करते हैं जो एक ही पर्यावरणीय आला27पर कब्जा करते हैं। हालांकि, ये जीवाणु एंजाइम उन्हें उत्पादित करने वाले मेजबान के लिए भी जोखिम पैदा कर सकते हैं। परिणामस्वरूप, एक जीन मेजबान द्वारा सह-व्यक्त किया जाता है जो विशेष रूप से एबी एंजाइम के कार्य को रोकता है और इसे प्रतिरक्षा प्रोटीन (आईएम) के रूप में जाना जाता है।
माइटोमाइसिन-सी और सिप्रोफ्लोक्सेसिन जैसे डीएनए-हानिकारक एंटीबायोटिक्स का उपयोग अक्सर शिगा टॉक्सिन-उत्पादक ई. कोलाई (एसटीईसी) में एसओएस प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, जिसका शिगा टॉक्सिन जीन(एसटीएक्स) बैक्टीरियल जीनोम28में मौजूद एक प्रोथेज जीनोम के भीतर पाया जाता है। हमने पहले एसटीईसी उपभेदों29,30, 31, 32द्वारा उत्पादित एसटीएक्स प्रकारों और उपप्रकारों का पता लगाने और पहचानने के लिए एंटीबायोटिक इंडक्शन, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएसकाउपयोग कियाहै। पिछले काम में, एसटीईसी O113: H21 तनाव RM7788 को माइटोमाइसिन-सी के साथ पूरक आगर मीडिया पर रातोंरात सुसंस्कृत किया गया था। हालांकि, m/z ~7816 पर Stx2a के प्रत्याशित बी-सबयूनिट का पता लगाने के बजाय, एम/जेड ~ 7839 पर एक अलग प्रोटीन आयन का पता लगाया गया था और अज्ञात समारोह33के एक प्लाज्मिड-एन्कोडेड काल्पनिक प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था। वर्तमान कार्य में, हमने एंटीबायोटिक इंडक्शन, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएस, और पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) से प्राप्त सिलिको प्रोटीन दृश्यों में प्रक्रिया और स्कैन करने के लिए विकसित स्टैंडअलोन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इस तनाव द्वारा उत्पादित दो प्लाज्मिड-एन्कोडेड एबी-आईएम प्रोटीन की पहचान की । इसके अलावा, अनुक्रम ट्रंकेशन से जुड़े पोस्ट-ट्रांसलेशन संशोधनों (पीटीएम) की संभावना को सॉफ्टवेयर में शामिल किया गया था। एस्पेरिक एसिड प्रभाव के कारण पीबीसी से परिपक्व प्रोटीन आयन और अनुक्रम-विशिष्ट खंड आयनों के मापा द्रव्यमान से इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान की गई थी और एमएस/एमएस-पीएसडी द्वारा पता लगाया गया था । अंत में, एक प्रमोटर एक प्लाज्मिड जीनोम में एबी/Im जीन के ऊपर की पहचान की गई थी जो इन जीनों की अभिव्यक्ति की व्याख्या कर सकता है जब यह तनाव डीएनए को नुकसान पहुंचाने वाली एंटीबायोटिक के संपर्क में आता है । इस कार्य के कुछ अंश नेशनल अमेरिकन केमिकल सोसायटी फॉल 2020 वर्चुअल मीटिंग एंड एक्सपो (17-20 अगस्त, 2020)34में प्रस्तुत किए गए थे।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियाइडल एंजाइमों के प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान करता है: एंटीबायोटिक प्रेरण का उपयोग करके रोगजनक एस्चेरिचिया कोलाई तनाव द्वारा उत्पादित कोलिसिन E3 और बैक्टीरियोसिन, और माल्डी-टीओएफ टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और इन-हाउस विकसित सॉफ्टवेयर के साथ टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण द्वारा पहचाना जाता है। कोलिकिन E3 (Im3) के प्रतिरक्षा प्रोटीन और जीवाणु (Im-Bac) के प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान एस्पार्टिक एसिड, ग्लूटामिक एसिड और एस्पार्टिक एसिड प्रभाव विखंडन तंत्र द्वारा सी-टर्मिनल साइड पर पॉलीपेप्टिड बैकबोन क्लीवेज (पीबीसी) द्वारा उत्पन्न प्रमुख बी-एंड/या वाई-टाइप खंड आयनों से की गई थी । सॉफ्टवेयर तेजी से सिलिको प्रोटीन दृश्यों में स्कैन बैक्टीरियल तनाव के पूरे जीनोम अनुक्रमण से प्राप्त किया । सॉफ्टवेयर भी पुनः एक प्रोटीन अनुक्रम के अमीनो एसिड अवशेषों को हटा घटना में है कि परिपक्व प्रोटीन अनुक्रम काट दिया है । एक एकल प्रोटीन अनुक्रम में प्रत्येक प्रतिरक्षा प्रोटीन के लिए पाए गए द्रव्यमान और खंड आयनों के अनुरूप होता है। इसके बाद उम्मीदवार अनुक्रम का मैन्युअल रूप से निरीक्षण किया गया ताकि यह पुष्टि की जा सके कि सभी पता लगाए गए खंड आयनों को सौंपा जा सकता है । Im3 के एन-टर्मिनल मेथियोनिन को अनुवाद के बाद हटा दिया गया था, जबकि आईएम-बीएसी का पूरा अनुक्रम था। इसके अलावा, हमने पाया कि सही प्रोटीन अनुक्रम की पहचान करने के लिए पीबीसी द्वारा गठित केवल दो या तीन गैर-पूरक खंड आयनों की आवश्यकता है। अंत में, एक प्रमोटर (एसओएस बॉक्स) जीवाणु तनाव के एक प्लाज्मिड जीनोम में जीवाणुरोधी और प्रतिरक्षा जीन के ऊपर की पहचान की गई थी ।

चित्रा 3 (शीर्ष पैनल) STEC O113 के एमएस से पता चलता है: H21 तनाव RM7788 LBA पर रातोंरात सुसंस्कृत ४०० एनजी के साथ पूरक/ एम/जेड ७२७६, ७३३७, और ७८४१ पर चोटियों पहले कोल्ड शॉक प्रोटीन सी (सीएसपीसी), कोल्ड शॉक प्रोटी...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

यहां हम घर में विकसित सॉफ्टवेयर के साथ माल्दी-टीओएफ-टीओएफ टैंडेम टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण का उपयोग करके जीनोमिक अनुक्रमित रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित प्रोटीन की तेजी से पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एस्पार्टिक एसिड प्रभाव के कारण मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों का टुकड़ा और प्रोटीन पहचान के लिए इस विशिष्टता का शोषण किया जाता है।

माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएस और टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबैक्टीरियल प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

प्रोटोकॉल एंटीबायोटिक प्रेरण और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर बैक्टीरियल प्रोटीन की पहचान के लिए एक तेजी से विधि को दर्शाता है । तकनीक का मुख्य लाभ यह गति और सादगी है। नमूना तैयारी सीधी है।तकनीक को किसी भी रोगजनक बैक्टीरिया के लक्षण वर्णन तक बढ़ाया जा सकता है, जैसे कि उग्रता कारक या एंटीबायोटिक प्रतिरोध बैक्टीरियल संक्रमण के लिए उचित उपचार को बेहतर तरह से सूचित करने के लिए। शुरू करने के लिए, पौंड आगर प्लेट पर उगाए जाने वाले एकल उपनिवेशों से फसल बैक्टीरिया के लिए एक बाँझ एक माइक्रोलीटर लूप का उपयोग करें। और एचपीएलसी-ग्रेड पानी के 300 माइक्रोलीटर युक्त दो मिलीलीटर ओ-रिंग रिंग लाइन स्क्रू कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।फिर संक्षेप में ट्यूब भंवर और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं गोली, स्टेनलेस स्टील MALDI लक्ष्य पर नमूना सुपरनैंट के एक ०.७५ माइक्रोलीटर अवशेष पानी पर, और इसे सूखने के लिए अनुमति देते हैं । सूखे नमूना स्थान को 33% एसीटोनिट्रिल, 67% पानी और 0.2% ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड में तैयार सिनापिनिक एसिड के संतृप्त समाधान के 0.75 माइक्रोलीटर के साथ ओवरले करें, और स्थान को सूखने दें। एक बार स्पॉट सूख जाने के बाद टारगेट को मास स्पेक्ट्रोमीटर में लोड करें।अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खोलें और एमएस लीनियर मोड अधिग्रहण या मास-टू-चार्ज रेंज और अपने संबंधित क्षेत्रों में निचले और ऊपरी सीमाओं के बड़े पैमाने पर चार्ज पर क्लिक करें। मालडी लक्ष्य टेम्पलेट पर विश्लेषण करने के लिए नमूना स्थान पर क्लिक करें। फिर बाएं माउस बटन को दबाना, और लेजर एब्लेशन या आयनीकरण के लिए नमूना लेने के लिए आयताकार क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के लिए नमूना स्थान पर कर्सर खींचें।अधिग्रहण शुरू करने और प्रत्येक नमूना स्थान के लिए 1000 लेजर शॉट्स इकट्ठा करने के लिए माउस बटन जारी करें। आयनों का पता नहीं कर रहे हैं, तो प्रोटीन आयन संकेत का पता चला है जब तक लेजर तीव्रता के तहत फिसलने पैमाने बार समायोजित करके लेजर तीव्रता में वृद्धि। एमएस लीनियर मोड एक्विजिशन पूरा होने के बाद एमएस/एमएस रिफ्लार्क मोड एक्विजिशन पर क्लिक करें ।अग्रदूत द्रव्यमान क्षेत्र में विश्लेषण करने के लिए अग्रदूत द्रव्यमान दर्ज करें। इसके बाद, अग्रदूत द्रव्यमान के कम और उच्च द्रव्यमान पक्ष के लिए अग्रदूत मास विंडो में डाल्टन में एक अलगाव चौड़ाई दर्ज करें। सीआईडी ऑफ बटन पर क्लिक करें।इसके बाद मेटास्टेबल दबाने वाले बटन पर क्लिक करें। लेजर तीव्रता को अपने अधिकतम मूल्य के कम से कम 90% तक समायोजित करें, जैसा कि प्रदर्शन किया गया है स्लाइडिंग स्केल बार को समायोजित करके। माल्डी लक्ष्य टेम्पलेट पर विश्लेषण करने के लिए नमूना स्थान पर क्लिक करें, फिर बाएं माउस बटन को दबाना, और लेजर एब्लेशन या आयनीकरण के लिए नमूना होने के लिए आयताकार क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के लिए नमूना स्थान पर कर्सर खींचें, अधिग्रहण शुरू करने के लिए माउस बटन जारी करें और प्रत्येक स्थान के लिए 10, 000 लेजर शॉट्स एकत्र करें जैसा कि प्रदर्शन किया गया है।प्रोटीन बायोमार्कर साधक निष्पादित फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें, और ग्राफिकल यूजर इंटरफेस विंडो दिखाई देगी। परिपक्व प्रोटीन मास क्षेत्र में प्रोटीन बायोमार्कर के द्रव्यमान और मास सहिष्णुता क्षेत्र में बड़े पैमाने पर माप त्रुटि दर्ज करें। वैकल्पिक रूप से, एक ख्यात मानार्थ खंड आयन जोड़ी से प्रोटीन द्रव्यमान की गणना करने के लिए मानार्थ बी/वाई आयन प्रोटीन मास कैलकुलेटर बटन पर क्लिक करें, और प्रोटीन मास कैलकुलेटर टूल की पॉप-अप विंडो दिखाई देगी ।ख्यात मानार्थ खंड आयन जोड़ी के अनुपात को चार्ज करने के लिए द्रव्यमान दर्ज करें, ऐड पेयर बटन पर क्लिक करें, और कैलकुलेटर प्रोटीन मास दिखाई देगा। परिपक्व प्रोटीन मास क्षेत्र में इस मूल्य को कॉपी करें, और प्रोटीन मास कैलकुलेटर टूल विंडो को बंद करें। सेट अवशेष प्रतिबंध बॉक्स पर क्लिक करें।अंत टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड लंबाई का चयन करें, और एक स्लाइडिंग स्केल और कर्सर के साथ पॉप-अप दिखाई देगा और कर्सर को वांछित सिग्नल पेप्टाइड लंबाई में ले जाएगा। यदि सिग्नल पेप्टाइड लंबाई का चयन नहीं किया जाता है, तो सॉफ्टवेयर द्वारा एक अप्रतिबंधित अनुक्रम ट्रंकेशन किया जाएगा। खंड आयन शर्त के तहत, एक या एक से अधिक अवशेषों, डी-ई-एन, और/या पी के बक्से पर क्लिक करके पॉलीपेप्टाइड बैकबोन क्लीवेज के लिए अवशेषों का चयन करें और फिर खोज बटन होने के लिए एंटर पीस आयन्स प्लस वन पर क्लिक करें, और पॉप-अप टुकड़ा पृष्ठ दिखाई देगा ।ऐड नातान आयन बटन पर अगला क्लिक करें, और प्रत्येक खंड आयन को दर्ज करने के लिए एक ड्रॉपडाउन फ़ील्ड दिखाई देगा। टुकड़ा आयनों के प्रभारी अनुपात और उनके संबंधित जन प्रभारी सहिष्णुता द्वारा बड़े पैमाने पर दर्ज करें । इसके बाद सेव एंड क्लोज बटन पर क्लिक करें।कितने खंड आयनों के दाईं ओर बॉक्स में मिलान करने की आवश्यकता है, टुकड़ा आयनों की न्यूनतम संख्या का चयन करने के लिए स्क्रॉल करें जो पहचान के लिए मिलान किया जाना चाहिए, और उनके ऑक्सीकरण राज्य में सिस्टीन अवशेषों का चयन करें। यदि खोज के बाद प्रोटीन की पहचान नहीं की जाती है, तो उनकी कम अवस्था में साइस्टीन के साथ खोज दोहराएं। फाइल सेटअप के तहत, पहले से निर्मित बैक्टीरियल स्ट्रेन के सिलिको प्रोटीन दृश्यों में शामिल फास्टा फाइल को ब्राउज़ करने और चुनने के लिए चुनिंदा फास्टा फाइल आइकन पर क्लिक करें।इसके बाद आउटपुट फोल्डर चुनें और आउटपुट फाइल नाम बनाएं। फ़ाइल प्रविष्टियों आइकन पर रन सर्च पर क्लिक करें। खोज शुरू होने से पहले खोज मापदंडों को प्रदर्शित करने वाले पुष्टि खोज मापदंडों के हकदार एक पॉपअप विंडो दिखाई देगी।और अगर खोज पैरामीटर सही हैं, तो खोज शुरू करें। यदि पैरामीटर गलत हैं, तो रद्द करें और सही मापदंडों को फिर से दर्ज करें। एक बार खोज शुरू होने के बाद, पैरामीटर विंडो बंद हो जाएगी और प्रगति बार के साथ एक नई पॉप-अप विंडो दिखाई देगी, जिसमें खोज की प्रगति और पाया गई पहचानों की संख्या का एक चल मिलान दिखाई देगा।खोज के पूरा होने पर, प्रगति बार स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा, और खोज का सारांश ग्राफिकल यूजर इंटरफेस के लॉग क्षेत्र में प्रदर्शित किया जाएगा, साथ ही एक नई पॉप-अप विंडो के साथ प्रोटीन पहचान प्रदर्शित करेगा। वर्तमान अध्ययन में, बैक्टीरियल संस्कृतियों को एलबी में माtomycin-C की दो अलग-अलग सांद्रता के साथ उगाया गया था। बैक्टीरिया संस्कृति का द्रव्यमान स्पेक्ट्रम एक माटोमाइसिन-सी एकाग्रता के साथ उगाया जाता है।कोल्ड शॉक प्रोटीन सी, कोल्ड शॉक प्रोटीन ई, और अज्ञात समारोह के एक प्लाज्मिड जनित प्रोटीन की पहचान की गई । ९७८० पर अज्ञात प्रोटीन आयन एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया था, और अग्रदूत आयन लगभग १०० डाल्टन के एक समय आयन चयनकर्ता खिड़की के साथ अलग किया गया था । 9675.9 चार्ज करने के लिए द्रव्यमान पर टुकड़ा आयन 9655 पर मेटास्टेबल प्रोटीन आयन के वियोजन से स्पिलओवर है।शूलिन E3 के लिए प्रतिरक्षा प्रोटीन के अनुक्रम आयनीकरण के बुनियादी अवशेष संभव साइटों में शामिल हैं। पॉलीपेप्टाइड बैकबोन क्लीवेज से पता लगाया गया टुकड़ा आयन, जब खोज के दौरान सिस्टीन के कम रूप का उपयोग किया गया था। एन-टर्मिनल मेथियोनिन को पोस्ट ट्रांसलेशन संशोधन के रूप में हटा दिया जाता है।जब बैक्टीरियल कल्चर को हाई माTomycin-C एकाग्रता पर उगाया गया तो बैक्टीरियासिन के इम्युनिटी प्रोटीन की पहचान की गई । ९६५१ पर अज्ञात चोटी एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया था, और अग्रदूत आयन शूंय से ७५ प्लस ६० डाल्टन के एक संकरा और असममित TIS खिड़की के साथ अलग किया गया था । बैक्टीरियोसिन के प्रतिरक्षा प्रोटीन के अनुक्रम में आयनीकरण के बुनियादी अवशेष संभावित स्थल होते हैं।पॉलीपेप्टाइड बैकबोन क्लीवेज से पता लगाया गया टुकड़ा आयन, जब खोज के दौरान सिस्टीन के कम रूप का उपयोग किया गया था। एंटीबायोटिक दवाओं की विभिन्न सांद्रता के साथ, सापेक्ष प्रोटीन बहुतायत भिन्न हो सकती है। और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके इनका विश्लेषण किया गया।बैक्टीरियल कोशिकाओं की कटाई करते समय, एंटीबायोटिक दवाओं और एकाग्रता के संबंध में कॉलोनी आकृति विज्ञान और बैक्टीरियल विकास का निरीक्षण करें। प्रोटीन का पता लगाने के लिए कोशिकाओं का एक माइक्रोलीटर लूप आवश्यक है।

Research

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Chemistry

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वानस्पतिक सामग्री का तेजी से उच्च throughput प्रजातियों की पहचान रीयल टाइम उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री में प्रत्यक्ष विश्लेषण का उपयोग

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

प्लांट टिश्यू से कार्बनिक अम्ल यों केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग: एक परीक्षण के मामले की जांच<em&gt; Coffea अरेबिका</em&gt; बीज

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

सीटू में परमाणु Microprobe विश्लेषण का उपयोग करके मेटल ऑक्साइड नैनोकणों का पता लगाना और एकल सेल ठहराव

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

डीएनए-चुंबकीय कण गतिशील और Electrophoretic प्रकाश कैटरिंग द्वारा बाध्यकारी विश्लेषण

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

बड़े पैमाने पर शीर्ष नीचे प्रोटियोमिक् केशिका जोन का उपयोग कर ट्रो मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

escherichiaकोलाई आधारित सेल मुक्त प्रोटीन संश्लेषण: एक मजबूत, लचीला, और सुलभ मंच प्रौद्योगिकी के लिए प्रोटोकॉल

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...