Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
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Il software Protein Biomarker Seeker è disponibile gratuitamente (senza alcun costo) contattando Clifton K. Fagerquist all'clifton.fagerquist@usda.gov. Desideriamo riconoscere il sostegno a questa ricerca da parte di ARS, USDA, CRIS grant: 2030-42000-051-00-D.

1. Preparazione microbiologica del campione
<ol><li>Inoculare 25 mL di brodo di Luria (LB) in un tubo conico da 50 mL con E. coli O113:H21 ceppo RM7788 (o un altro ceppo batterico) da un ceppo di glicerolo utilizzando un anello sterile da 1 μL. Tappare il tubo e la precoltura a 37 °C con agitazione (200 giri/min) per 4 ore.</li>
	<li>Aliquota 100 μL di brodo precolturato e spalmabile su una piastra di agar LB integrata con 400 o 800 ng/mL di mitomicina-C. Coltura di piastre di agar staticamente durante la n...

Considerazioni sul protocollo I punti di forza principali del protocollo attuale sono la sua velocità, la semplicità di preparazione del campione e l'uso di uno strumento relativamente facile da usare, da addestrare e mantenere. Sebbene l'analisi proteomica bottom-up e top-down mediante cromatografia liquida-ESI-HR-MS sia onnipresente e di gran lunga superiore sotto molti aspetti all'top-down di MALDI-TOF-TOF, richiedono più tempo, lavoro e competenza. La complessità dello strumento può spesso in...

L'analisi e l'identificazione di proteine non digerite mediante spettrometria di massa è indicata come analisi proteomica top-down1,2,3,4. È ormai una tecnica consolidata che utilizza analizzatori di massa elettrospray (ESI)5 e ad alta risoluzione6e sofisticate tecniche di dissociazione, ad esempio dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD), dissociazione a cattura elettronica (ECD)7,fotossociazione ultravioletta (UV-PD)8, ecc.
L'altra tecnica di ionizzazione morbida è il desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI)9,10,11 che è stato meno ampiamente utilizzato per l'analisi top-down, in parte perché è principalmente accoppiato agli analizzatori di massa a tempo di volo (TOF), che hanno una risoluzione limitata rispetto ad altri analizzatori di massa. Nonostante queste limitazioni, gli strumenti MALDI-TOF e MALDI-TOF-TOF sono stati sfruttati per la rapida analisi top-down di proteine pure e miscele frazionate e non frazionate di proteine. Per l'identificazione di proteine pure, il decadimento in-source (ISD) è una tecnica particolarmente utile perché consente l'analisi di spettrometria di massa (MS) di ioni frammento ISD, nonché la spettrometria di massa tandem (MS/MS) di frammenti ionici proteici fornendo frammenti specifici di sequenza spesso dai termini N- e C della proteina bersaglio, analogamente al sequenziamento Edman12,13 . Uno svantaggio dell'approccio ISD è che, come nel sequenziamento di Edman, il campione deve contenere una sola proteina. L'unico requisito proteico è dovuto alla necessità di attribuire in modo inequivocabile gli ioni frammento a uno ione precursore. Se due o più proteine sono presenti in un campione, può essere difficile assegnare quali ioni frammento appartengono a quali ioni precursori.
L'attribuzione di ioni frammento/ione precursore può essere affrontata utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Come con qualsiasi esperimento classico di MS/MS, gli ioni precursori sono selezionati/isolati in massa prima della frammentazione e gli ioni frammento rilevati possono essere attribuiti a uno specifico ione precursore. Tuttavia, le tecniche di dissociazione disponibili per questo approccio sono limitate principalmente alla dissociazione indotta da collisioni ad alta energia (HE-CID)14 o al decadimento post-sorgente (PSD)15,16. HE-CID e PSD sono più efficaci nel frammentare peptidi e piccole proteine e la copertura della sequenza può, in alcuni casi, essere limitata. Inoltre, la PSD provoca la scissione della spina dorsale polipeptidica (PBC) principalmente sul lato C-terminale dei residui di acido aspartico e glutammico da un fenomeno chiamato effetto acido aspartico17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS ha anche trovato un'applicazione di nicchia nell'identificazione tassonomica dei microrganismi: batteri21, funghi22e virus23. Ad esempio, gli spettri MS vengono utilizzati per identificare batteri sconosciuti rispetto a una libreria di riferimento di spettri MS di batteri noti utilizzando algoritmi di riconoscimento dei modelli per il confronto. Questo approccio si è rivelato di grande successo grazie alla sua velocità e semplicità, sebbene richieda una coltivazione notturna dell'isolato. Gli ioni proteici rilevati da questo approccio (di solito sotto i 20 kDa) comprendono un'impronta digitale MS che consente la risoluzione tassonomica a livello di genere e specie e in alcuni casi alla sottospecie24 e al livello di ceppo25,26. Tuttavia, rimane la necessità non solo di classificare tassonomicamente i microrganismi potenzialmente patogeni, ma anche di identificare specifici fattori di virulenza, tossine e fattori di resistenza antimicrobica (AMR). Per raggiungere questo obiettivo, la massa di peptidi, proteine o piccole molecole viene misurata dalla SM e successivamente isolata e frammentata dalla SM / MS.
I batteri patogeni spesso trasportano pezzi circolari di DNA chiamati plasmidi. I plasmidi, insieme ai profagi, sono un importante vettore di trasferimento genico orizzontale tra batteri e sono responsabili della rapida diffusione della resistenza antimicrobica e di altri fattori di virulenza tra i batteri. I plasmidi possono anche trasportare geni antibatterici (AB), ad esempio colicina e batteriocina. Quando questi geni sono espressi e le proteine secrete, agiscono per disabilitare il meccanismo di traduzione proteica dei batteri vicini che occupano la stessa nicchia ambientale27. Tuttavia, questi enzimi battericidi possono anche rappresentare un rischio per l'ospite che li ha prodotti. Di conseguenza, un gene è co-espresso dall'ospite che inibisce specificamente la funzione di un enzima AB e viene indicato come la sua proteina immunitaria (Im).
Gli antibiotici dannosi per il DNA come la mitomicina-C e la ciprofloxacina sono spesso usati per indurre la risposta SOS nell'E. coli produttore della tossina Shiga (STEC) il cui gene della tossina Shiga(stx) si trova all'interno di un genoma di profago presente nel genoma batterico28. Abbiamo utilizzato l'induzione antibiotica, MALDI-TOF-TOF-MS/MS e l'analisi proteomica top-down in precedenza per rilevare e identificare tipi e sottotipi di Stx prodotti dai ceppi STEC29,30,31,32. Nel lavoro precedente, il ceppo STEC O113:H21 RM7788 è stato coltivato durante la notte su mezzi di agar integrati con mitomicina-C. Tuttavia, invece di rilevare la subunità B prevista di Stx2a a m / z ~7816, è stato rilevato uno ione proteico diverso a m / z ~ 7839 e identificato come una proteina ipotetica codificata con plasmidi di funzione sconosciuta33. Nel lavoro attuale, abbiamo identificato due proteine AB-Im codificate con plasmidi prodotte da questo ceppo utilizzando l'induzione antibiotica, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS e l'analisi proteomica top-down utilizzando un software autonomo sviluppato per elaborare e scansionare sequenze proteiche in silico derivate dal sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Inoltre, nel software è stata incorporata la possibilità di modifiche post-traduzione (PTM) che comportano il troncamento della sequenza. Le proteine immunitarie sono state identificate utilizzando questo software dalla massa misurata dello ione proteina matura e dagli ioni frammento specifici della sequenza da PBC causati dall'effetto dell'acido aspartico e rilevati da MS / MS-PSD. Infine, è stato identificato un promotore a monte dei geni AB / Im in un genoma plasmidico che può spiegare l'espressione di questi geni quando questo ceppo è esposto a un antibiotico dannoso per il DNA. Parti di questo lavoro sono state presentate al National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 agosto 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

Questo protocollo identifica le proteine immunitarie degli enzimi battericidi: colicina E3 e batteriocina, prodotte da un ceppo patogeno di Escherichia coli mediante induzione antibiotica, e identificate dalla spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e dall'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. La proteina immunitaria della colicina E3 (Im3) e la proteina immunitaria della batteriocina (Im-Bac) sono state identificate da prominenti ioni frammento di tipo b e/o y generati dalla scissione della spina dorsale polipeptidica (PBC) sul lato C-terminale dell'acido aspartico, dell'acido glutammico e dei residui di asparagina mediante il meccanismo di frammentazione dell'effetto dell'acido aspartico. Il software scansiona rapidamente in silico sequenze proteiche derivate dal sequenziamento dell'intero genoma del ceppo batterico. Il software rimuove inoltre iterativamente i residui di amminoacidi di una sequenza proteica nel caso in cui la sequenza proteica matura venga troncata. Una singola sequenza proteica possedeva ioni di massa e frammento coerenti con quelli rilevati per ciascuna proteina immunitaria. La sequenza candidata è stata quindi ispezionata manualmente per confermare che tutti gli ioni frammento rilevati potessero essere assegnati. La metionina N-terminale di Im3 è stata rimossa post-traduzionalmente, mentre Im-Bac ha avuto la sequenza completa. Inoltre, abbiamo scoperto che solo due o tre ioni frammento non complementari formati da PBC sono necessari per identificare la corretta sequenza proteica. Infine, è stato identificato un promotore (SOS box) a monte dei geni antibatterici e immunitari in un genoma plasmidiale del ceppo batterico.

La Figura 3 (pannello superiore) mostra la MS del ceppo STEC O113:H21 RM7788 coltivato durante la notte su LBA integrato con 400 ng/mL di mitomicina-C. I picchi a m/z 7276, 7337 e 7841 erano stati identificati in precedenza come proteina C (CspC), proteina E (CspE) e una proteina a plasmide di funzione sconosciuta, rispettivamente33. Lo ione proteico a m/z 9780 [M+H]+ è stato analizzato da MS/MS-PSD come mostrato nella Figura 3</strong...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qui presentiamo un protocollo per la rapida identificazione di proteine prodotte da batteri patogeni sequenziati genomicamente utilizzando la spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e l'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. Gli ioni proteici metastabili si frammentano a causa dell'effetto dell'acido aspartico e questa specificità viene sfruttata per l'identificazione delle proteine.

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Il protocollo dimostra un metodo rapido per l'identificazione di proteine batteriche utilizzando l'induzione antibiotica e la spettrometria di massa. Il vantaggio principale della tecnica è la sua velocità e semplicità. La preparazione del campione è semplice.La tecnica può essere estesa alla caratterizzazione di eventuali batteri patogeni, come fattori di virulenza o resistenza agli antibiotici per informare meglio il trattamento appropriato per un'infezione batterica. Per iniziare, utilizzare un anello sterile di un microlitro per raccogliere i batteri da singole colonie coltivate su piastra di agar LB. E trasferisci in un tubo microcentrifuga a vite a due millilitri con tappo a vite ad anello O-ring contenente 300 microlitri di acqua di grado HPLC.Quindi vorticosamente brevemente il tubo e pellet le celle per centrifugazione, a 0,75 microliti di acqua reliquia del surnatante campione sul bersaglio MALDI in acciaio inossidabile, e lasciarlo asciugare. Sovrapporre il punto del campione essiccato con 0,75 microlitri di una soluzione satura di acido sinapinico preparata in 33% acetonitrile, 67% acqua e 0,2% acido trifluoroacetico e lasciare asciugare il punto. Una volta che il punto è asciutto, caricare il bersaglio nello spettrometro di massa.Aprire il software di acquisizione e fare clic su MS Linear Mode Acquisition o mass-to-charge range e mass-to-charge dei limiti inferiore e superiore nei rispettivi campi. Fare clic sul punto di esempio da analizzare sul modello di destinazione MALDI. Quindi premere il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore sul punto campione per specificare la regione rettangolare da campionare per un'ablazione o una ionizzazione laser.Rilascia il pulsante del mouse per avviare l'acquisizione e raccogli 1000 colpi laser per ogni punto campione. Se gli ioni non vengono rilevati, aumentare l'intensità del laser regolando la barra della scala scorrevole sotto l'intensità del laser fino a quando non viene rilevato il segnale ionica proteico. Dopo aver completato l'acquisizione della modalità lineare MS, fare clic su MS/MS Reflectron Mode Acquisition.Immettere la massa del precursore da analizzare nel campo Massa precursore. Quindi, immettere una larghezza di isolamento in dalton nella finestra Massa precursore per il lato di massa bassa e alta della massa precursore. Fare clic sul pulsante CID Off.Quindi fare clic sul pulsante Soppressore metastabile acceso. Regolare l'intensità del laser ad almeno il 90% del suo valore massimo regolando la barra della scala scorrevole come dimostrato. Fare clic sul punto campione da analizzare sul modello di destinazione MALDI, quindi premere il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore sul punto campione per specificare la regione rettangolare da campionare per l'ablazione o la ionizzazione laser, rilasciare il pulsante del mouse per avviare l'acquisizione e raccogliere 10.000 colpi laser per ogni punto campione come dimostrato.Fare doppio clic sul file eseguibile del cercatore di biomarcatori proteici e verrà visualizzata la finestra dell'interfaccia utente grafica. Immettere la massa del biomarcatore proteico nel campo Massa proteica matura e l'errore di misurazione della massa nel campo Tolleranza di massa. Facoltativamente, fai clic sul pulsante Calcolatore di massa proteica a ioni b/anno gratuito per calcolare la massa proteica da una presunta coppia di ioni frammento complementare e verrà visualizzata la finestra pop-up dello strumento Calcolatore di massa proteica.Inserisci il rapporto massa/carica della presunta coppia di ioni frammento complementare, fai clic sul pulsante Aggiungi coppia e apparirà la massa proteica calcolatrice. Copia incolla questo valore nel campo Massa proteica matura e chiudi la finestra degli strumenti Calcolatore di massa proteica. Fare clic sulla casella Imposta restrizione residui.Selezionare la lunghezza del peptide del segnale terminale finale e il pop-up con una scala scorrevole e un cursore apparirà e sposterà il cursore sulla lunghezza del peptide del segnale desiderata. Se la lunghezza del peptide del segnale non è selezionata, il software eseguirà un troncamento di sequenza senza restrizioni. Sotto la condizione di ione del frammento, selezionare i residui per la scissione della spina dorsale polipeptidiche facendo clic sulle caselle di uno o più residui, D-E-N e / o P.E quindi fare clic sul pulsante Inserisci ioni frammento più uno da cercare e verrà visualizzata la pagina del frammento pop-up.Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi ione frammento e verrà visualizzato un campo a discesa per ogni ione frammento da inserire. Immettere i rapporti massa per carica degli ioni frammento e la loro massa associata mediante tolleranza di carica. Quindi fare clic sul pulsante Salva e chiudi.Nella casella sul lato destro di Quanti ioni frammento devono essere abbinati, scorrere per selezionare il numero minimo di ioni frammento che devono essere abbinati per l'identificazione e selezionare i residui di cisteina nel loro stato ossidato. Se le proteine non vengono identificate dopo la ricerca, ripetere la ricerca con ciste nel loro stato ridotto. Sotto l'impostazione del file, fare clic sull'icona Seleziona file FASTA per sfogliare e selezionare il file FASTA contenente le sequenze proteiche in silico del ceppo batterico precedentemente costruito.Quindi selezionare una cartella di output e creare un nome di file di output. Fare clic sull'icona Esegui ricerca su voci di file. Apparirà una finestra popup intitolata Conferma parametri di ricerca che visualizza i parametri di ricerca prima dell'avvio della ricerca.E se i parametri di ricerca sono corretti, fai clic su Inizia ricerca. Se i parametri non sono corretti, fare clic su Annulla e immettere di riconserci i parametri corretti. Una volta avviata la ricerca, la finestra dei parametri si chiuderà e apparirà una nuova finestra pop-up con una barra di avanzamento, che mostra l'avanzamento della ricerca e un conteggio in esecuzione del numero di identificazioni trovate.Al termine della ricerca, la barra di avanzamento verrà chiusa automaticamente e un riepilogo della ricerca verrà visualizzato nel campo di registro dell'interfaccia utente grafica insieme a una nuova finestra pop-up che mostra le identificazioni proteiche trovate. Nel presente studio, colture batteriche sono state coltivate in LB con due diverse concentrazioni di mitomicina-C. Lo spettro di massa della coltura batterica cresciuto con una concentrazione di mitomicina-C.Sono state identificate la proteina C dello shock freddo, la proteina E dello shock freddo e una proteina trasmessa dal plasmide di funzione sconosciuta. Lo ione proteina sconosciuto a 9780 è stato analizzato da MS / MS, e lo ione precursore è stato isolato con una finestra di selezione dello ione temporale di circa 100 dalton. Lo ione frammento alla massa per caricare 9675,9 è spillover dalla dissociazione dello ione proteina metastabile a 9655.La sequenza della proteina immunitaria per la colicina E3 contiene residui di base possibili siti di ionizzazione. Gli ioni frammento rilevati dalla scissione della spina dorsale polipeptidica, quando la forma ridotta di cisteina è stata utilizzata durante la ricerca. La metionina N-terminale viene rimossa come modifica post traduzione.Quando la coltura batterica è stata coltivata ad un'alta concentrazione di mitomicina-C, è stata identificata la proteina immunitaria della batteriocina. Il picco sconosciuto a 9651 è stato analizzato da MS/MS e lo ione precursore è stato isolato con una finestra TIS più stretta e asimmetrica di meno 75 più 60 dalton. La sequenza della proteina immunitaria della batteriocina contiene residui di base possibili siti di ionizzazione.Gli ioni frammento rilevati dalla scissione della spina dorsale polipeptidica, quando la forma ridotta di cisteina è stata utilizzata durante la ricerca. con le diverse concentrazioni di antibiotici, l'abbondanza relativa di proteine può variare. E questi sono stati analizzati usando la spettrometria di massa.Quando si raccolgono le cellule batteriche, osservare la morfologia della colonia e la crescita batterica rispetto agli antibiotici e alla concentrazione. Un ciclo di cellule di un microlitro è necessario per rilevare le proteine.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

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Identificazione qualitativa di acidi carbossilici, acidi bo e ammine Utilizzando Fluorofori Cruciform

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Ricerca

Chimica

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