Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
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プロテインバイオマーカーシーカーソフトウェアは、clifton.fagerquist@usda.gov でクリフトンK.Fagerquistに連絡することで、無料で(無料で)自由に利用できます。我々は、ARS、USDA、CRIS助成金によるこの研究の支援を認めてほしい:2030-42000-051-00-D。

1. 微生物学的サンプル調製
<ol><li>無菌1 μLループを使用してグリセロールストックから50 mL円錐管に25 mLのルリアスープ(LB)を大 腸菌 O113:H21株RM7788(または別の細菌株)を接種します。チューブをキャップし、4時間振る(200rpm)で37°Cで前培養します。</li>
	<li>アリコート100 μLの前培養ブロスを400または800 ng/mLのミトマイシンCを補ったLB寒天プレートに広げる。培養寒天プレートを37°Cのイン...

プロトコルに関する考慮事項 現在のプロトコルの主な強みは、その速度、サンプル調製のシンプルさ、および操作が比較的容易で、訓練され、維持される楽器の使用です。液体クロマトグラフィー-ESI-HR-MSによるボトムアップおよびトップダウンプロテオミクス分析は、MALDI-TOF-TOFによるトップダウンに対して多くの点で普及していますが、より多くの時間、労力、専門知識が?...

質量分析法による未消化タンパク質の分析および同定は、トップダウンプロテオーム解析1、2、3、4と呼ばれる。エレクトロスプレーイオン化(ESI)5と高解像度質量分析計6を利用した技術として確立され、高度な解離技術、例えば電子転写解離(ETD)、電子捕捉解離(ECD)7、紫外線光解離(UV-PD)8、等を利用する技術が確立されている。
他のソフトイオン化技術は、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化(MALDI)9、10、11であり、主に飛行時間(TOF)質量分析装置と結合されているため、トップダウン分析にはあまり広く利用されておらず、他の質量分析装置と比較して分解能が限られている。これらの制限にもかかわらず、MALDI-TOFおよびMALDI-TOF-TOFの装置は、純粋なタンパク質の迅速なトップダウン分析と、タンパク質の分画および未分化混合物のために利用されてきました。純粋なタンパク質の同定のために、インソース崩壊(ISD)は、ISD断片イオンの質量分析(MS)分析、ならびに標的のN-およびC末筋からしばしば配列特異的断片を提供するタンパク質イオン断片のタンデム質量分析(MS/MS)を可能にするため、特に有用な技術である。.ISD アプローチの欠点は、エドマンシーケンシングと同様に、サンプルに含まれているタンパク質が 1 つだけである点です。1つのタンパク質要件は、前駆体イオンへのフラグメントイオンの明確なアトリビューションの必要性によるものです。サンプルに複数のタンパク質が存在する場合、どのフラグメントイオンがどの前駆物質に属しているかは、割り当てが難しい場合があります。
フラグメントイオン/前駆体イオンアトリビューションは、MALDI-TOF-TOF-MS/MSを使用して対処することができます。従来のMS/MS実験と同様に、前駆体イオンは断片化の前に質量選択/単離され、検出されたフラグメントイオンは特定の前駆体イオンに起因する可能性があります。しかしながら、このアプローチで利用可能な解離技術は、主に高エネルギー衝突誘発解離(HE-CID)14またはポストソース崩壊(PSD)15,16に限定される。HE-CIDおよびPSDは、ペプチドおよび小タンパク質の断片化に最も効果的であり、配列被覆範囲は、場合によっては制限される可能性がある。また、PSDは、アスパラギン酸効果17、18、19、20と呼ばれる現象によって、主にアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基のC末端側にポリペプチド骨格切断(PBC)をもたらす。
MALDI-TOF-MSはまた、微生物の分類学的同定におけるニッチな用途を発見しました: 細菌21、 真菌22、およびウイルス23.例えば、MSスペクトルは、比較のためにパターン認識アルゴリズムを用いて既知の細菌のMSスペクトルの参照ライブラリーと比較して未知の細菌を同定するために使用される。このアプローチは、その速度とシンプルさのために非常に成功していますが、分離物の一晩の培養が必要です。このアプローチによって検出されたタンパクイオン(通常は20kDa以下)は、属および種レベルでの分類学的分解能を可能にするMS指紋を含み、場合によってはサブ種24および株レベル25、26で。しかし、病原性の可能性のある微生物を分類的に分類するだけでなく、特定の病原性因子、毒素、抗菌性(AMR)因子を同定する必要があります。これを達成するために、ペプチド、タンパク質、または小分子の質量をMSによって測定し、その後MS/MSによって単離され、断片化されます。
病原性細菌は、しばしばプラスミドと呼ばれるDNAの円形の断片を運ぶ。プラスミドは、プロファージと共に、細菌間の水平遺伝子導入の主要なベクターであり、細菌間で抗菌性および他の毒性因子の急速な広がりを引き起す。プラスミドはまた、抗菌(AB)遺伝子、例えば、コリシンおよびバクテリオシンを運ぶことができる。これらの遺伝子が発現し、タンパク質が分泌されると、それらは、同じ環境ニッチ27を占める隣接細菌のタンパク質翻訳機械を無効にする作用をする。しかし、これらの殺菌酵素は、それらを産生する宿主にリスクをもたらす可能性もある。その結果、遺伝子は、AB酵素の機能を特異的に阻害し、その免疫タンパク質(Im)と呼ばれる宿主によって共発現される。
マイトマイシンCやシプロフロキサシンなどのDNA損傷性抗生物質は、細菌ゲノム28に存在するプロファージゲノム内に滋賀毒素遺伝子(stx)が見つかる滋賀毒素産生大腸菌(STEC)においてSOS応答を誘導するためによく用いられる。我々は、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス分析を使用して、STEC株29、30、31、32によって産生されるStx型およびサブタイプを検出し、同定した。前の研究では、STEC O113:H21株RM7788は、マイトマイシンCを補充した寒天培地上で一晩培養した。しかし、m/z~7816で予想されるStx2aのBサブユニットを検出する代わりに、m/z〜7839で異なるタンパク質イオンが検出され、未知の機能33のプラスミドコード化された仮説タンパク質として同定された。今回の研究では、全ゲノムシーケンシング(WGS)由来のインシリコタンパク質配列を処理およびスキャンするために開発されたスタンドアロンソフトウェアを用いて、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス解析を用いて、この株によって産生される2つのプラスミドコード化AB-Imタンパク質を同定した。さらに、シーケンス切り捨てを伴う翻訳後改変(PTM)の可能性がソフトウェアに組み込まれました。免疫タンパク質は、アスパラギン酸効果によって引き起こされたPBCからの成熟タンパク質イオンおよび配列特異的フラグメントイオンの測定質量からこのソフトウェアを使用して同定され、MS/MS-PSDによって検出された。最後に、この株がDNA損傷性抗生物質にさらされたときにこれらの遺伝子の発現を説明することができるプラスミドゲノム中のAB/Im遺伝子の上流にプロモーターが同定された。この作品の一部は、2020年8月17-20日の仮想会議&博覧会(2020年8月17-20日)34で発表された。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

このプロトコルは、抗生物質誘導を使用して病原性 大腸菌 株によって産生されるコリシンE3およびバクテリオシンの殺菌酵素の免疫タンパク質を同定し、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法およびトップダウンプロテオミクス分析によって社内で開発されたソフトウェアで同定される。アシシンE3(Im3)の免疫タンパク質とバクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン残基のC末端側のポリペプチド骨格切断(PBC)によって生成された顕著なb-および/またはy型断片イオンから同定された。このソフトウェアは、細菌株の全ゲノムシーケンシングに由来する インシリコ タンパク質配列を迅速にスキャンします。また、このソフトウェアは、成熟タンパク質配列が切り捨てられた場合にタンパク質配列のアミノ酸残基を繰りつ離します。1つのタンパク質配列は、各免疫タンパク質について検出されたものと一致する質量およびフラグメントイオンを有する。候補シーケンスを手動で検査し、検出されたすべてのフラグメントイオンが割り当てられることを確認しました。Im3のN末端メチオニンは翻訳後に除去されたのに対し、Im-Bacは完全な配列を持っていた。さらに、正しいタンパク質配列を同定するためにPBCによって形成された非相補性フラグメントイオンは2~3個しか必要でないことがわかりました。最後に、プロモーター(SOSボックス)を、細菌株のプラスミドゲノム中の抗菌遺伝子および免疫遺伝子の上流で同定した。

図3(上パネル)は、400 ng/mLミトマイシン-Cを補充したLBA上で一晩培養したSTEC O113:H21株RM7788のMSを示す。m/z 7276、7337、および7841のピークは、以前はコールドショックタンパク質C(CspC)、コールドショックプロテインE(CspE)、および未知の機能を有するプラスミド媒介タンパク質と同定されていた。m/z 9780[M+H]+におけるタンパク質イオンを<strong class="xfig...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

このプロトコルは、抗生物質誘導および質量分析を用いて細菌タンパク質を同定するための迅速な方法を示す。この技術の主な利点は、スピードとシンプルさです。サンプル調製は複雑ではありません。この技術は、細菌感染に対する適切な治療をより良く知らせるために、病原性因子や抗生物質耐性などの病原性細菌の特性評価に拡張することができる。まず、LB寒天プレートで成長した単一コロニーから細菌を収穫するために無菌1マイクロリットルループを使用してください。300マイクロリットルのHPLCグレードの水を含む2ミリリットルOリングリングラインスクリューキャップマイクロ遠心分離チューブに移します。次に、チューブとペレットを遠心分離によって細胞を短時間ボルテックスし、ステンレス鋼MALDIターゲット上のサンプル上清の0.75マイクロリットルの残膜水で、乾燥させる。乾燥したサンプルスポットを、33%アセトニトリル、67%水、0.2%トリフルオロ酢酸で調製したシナピエン酸の飽和溶液の0.75マイクロリットルでオーバーレイし、その点を乾燥させます。スポットを乾燥させたら、質量分析計にターゲットをロードします。取得ソフトウェアを開き、[MS リニア モード取得] または [一括充電範囲] をクリックし、下限と上限の質量対充電をそれぞれのフィールドに入力します。MALDI ターゲット テンプレートで分析するサンプル スポットをクリックします。次に、マウスの左ボタンを押し下げ、サンプルスポット上にカーソルをドラッグして、レーザーアブレーションまたはイオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定します。マウスボタンを放して取得を開始し、サンプルスポットごとに1000本のレーザーショットを収集します。イオンが検出されない場合は、タンパク質イオンシグナルが検出されるまでレーザー強度の下でスライドスケールバーを調整してレーザー強度を増加させます。MS リニア モード取得が完了したら、MS/MS 反射モード取得をクリックします。解析する前駆体質量を前駆体質量フィールドに入力します。次に、前駆体質量の低質量側と高質量側の「前駆体質量」ウィンドウに、ダルトンの分離幅を入力します。[CID オフ] ボタンをクリックします。次に、[メタスタブル サプレッサーオン]ボタンをクリックします。スライドスケールバーを調整して、レーザ強度を最大値の 90% 以上に調整します。MALDIターゲットテンプレートで分析するサンプルスポットをクリックし、マウスの左ボタンを押下し、サンプルスポット上にカーソルをドラッグしてレーザーアブレーションまたはイオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定し、マウスボタンを放して取得を開始し、各サンプルスポットに対して10,000本のレーザーショットを収集します。プロテインバイオマーカー Seeker 実行可能ファイルをダブルクリックすると、グラフィカルユーザーインターフェースウィンドウが表示されます。「成熟タンパク質量」フィールドにタンパク質バイオマーカーの質量を入力し、質量トレランスフィールドに質量測定誤差を入力します。必要に応じて、無料のb / yイオンタンパク質量計算ボタンをクリックして、推定された無料のフラグメントイオンペアからタンパク質量を計算すると、タンパク質量計算ツールのポップアップウィンドウが表示されます。推定された無料のフラグメントイオンペアの質量と充電の比率を入力し、[ペアを追加]ボタンをクリックすると、電卓タンパク質量が表示されます。[成熟したタンパク質量]フィールドにこの値をコピーして貼り付け、[タンパク質量計算]ツールウィンドウを閉じます。[残留の制限を設定]ボックスをクリックします。エンド・シグナル・ペプチド長を選択すると、スライドスケールとカーソルを持つポップアップが現れ、カーソルを希望するシグナル・ペプチド長に移動します。シグナルペプチド長が選択されていない場合、無制限のシーケンス切り捨てがソフトウェアによって実行されます。フラグメントイオン条件の下で、1つ以上の残基、D-E-N、および/またはP.のボックスをクリックしてポリペプチドバックボーン切断の残基を選択し、フラグメントイオンプラス1を入力して検索ボタンをクリックすると、ポップアップフラグメントページが表示されます。次にフラグメントイオンの追加ボタンをクリックすると、入力するフラグメントイオンごとにドロップダウンフィールドが表示されます。フラグメントイオンの電荷比と関連する質量を、電荷許容差で質量を入力します。次に、[保存して閉じる] ボタンをクリックします。「一致する必要があるフラグメントイオンの数」の右側のボックスで、スクロールして、識別のために一致させる必要があるフラグメントイオンの最小数を選択し、酸化状態のシステイン残基を選択します。検索後にタンパク質が同定されない場合は、システインを減少させた状態で検索を繰り返します。ファイル設定で、[FASTA ファイルの選択] アイコンをクリックして、以前に構築した細菌株のインシリコタンパク質配列を含む FASTA ファイルを参照して選択します。次に、出力フォルダーを選択し、出力ファイル名を作成します。[ファイル エントリで検索を実行]アイコンをクリックします。検索が開始される前に検索パラメータを表示する「検索パラメータの確認」というポップアップウィンドウが表示されます。検索パラメータが正しい場合は、[検索の開始] をクリックします。パラメータが正しくない場合は、[キャンセル]をクリックして、正しいパラメータを再入力します。検索が開始されると、パラメータウィンドウが閉じ、新しいポップアップウィンドウが表示され、検索の進行状況と見つかった識別数の集計が表示されます。検索が完了すると、プログレスバーが自動的に閉じられ、検索の概要が、検出されたタンパク質の識別情報を表示する新しいポップアップウィンドウと共に、グラフィカルユーザーインターフェースのログフィールドに表示されます。現在の研究では、細菌培養物は、2つの異なる濃度のマイトマイシンCを有するLBで増殖した。菌培養物の質量スペクトルは、マイトマイシン-C濃度で増殖した。コールドショックタンパク質C、コールドショックタンパク質E、および機能不明のプラスミド媒介タンパク質が同定された。9780で未知のタンパク質イオンをMS/MSで分析し、前駆イオンを約100ダルトンのタイムイオン選択窓で単離した。質量で9675.9を電荷するフラグメントイオンは、9655でのメタスタブルタンパク質イオンの解離から波及する。コリシンE3の免疫タンパク質の配列は、イオン化の可能な部位の基本的な残基を含む。ポリペプチド骨格切断から検出されたフラグメントイオンを、システインの還元形態を探索中に使用した場合。N末端メチオニンは、翻訳後の変更として除去されます。細菌培養を高いマイトマイシン-C濃度で増殖させた場合、バクテリオシンの免疫タンパク質が同定された。9651の未知のピークをMS/MSで分析し、前駆体イオンはマイナス75プラス60ダルトンのより狭く非対称的なTISウィンドウで単離された。バクテリオシンの免疫タンパク質の配列には、イオン化の可能な部位の塩基残基が含まれています。ポリペプチド骨格切断から検出されたフラグメントイオンを、システインの還元形態を探索中に使用した場合。抗生物質の異なる濃度で, 相対的なタンパク質の豊富さは異なる場合があります。.そして、これらは質量分析を用いて分析した。細菌細胞を収穫する場合は、抗生物質や濃度に関してコロニーの形態と細菌の増殖を観察する。タンパク質を検出するには、1マイクロリットルの細胞ループが必要です。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

カルボン酸、ボロン酸、およびアミンの定性的同定は十字フルオロフォアを使用

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

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合成タンパク質の最適化：中間物挿入依存関係の同定構造的インジケートおよび/または機能的に連結された残基

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

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植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます<em&gt;コーヒーノキアラビカ</em&gt;種子

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その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

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バインドの動的・電気泳動光散乱による解析 DNA 磁性粒子

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

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Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

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