Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
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El software Protein Biomarker Seeker está disponible gratuitamente (sin costo) poniéndose en contacto con Clifton K. Fagerquist en clifton.fagerquist@usda.gov. Deseamos agradecer el apoyo a esta investigación por parte de ARS, USDA, cris grant: 2030-42000-051-00-D.

1. Preparación microbiológica de muestras
<ol><li>Inocular 25 ml de caldo de Luria (LB) en un tubo cónico de 50 ml con E. coli O113:H21 cepa RM7788 (u otra cepa bacteriana) de una cepa de glicerol utilizando un asa estéril de 1 μL. Tapar el tubo y preculterr a 37 °C con agitación (200 rpm) durante 4 h.</li>
	<li>Alícuota de 100 μL de caldo preculto y untar sobre una placa de agar LB suplementada con 400 u 800 ng/mL de mitomicina-C. Cultivar placas de agar estáticamente durante la noche en una incubad...

Consideraciones sobre el protocolo Las principales fortalezas del protocolo actual son su velocidad, simplicidad de preparación de muestras y uso de un instrumento que es relativamente fácil de operar, entrenar y mantener. Aunque el análisis proteómico de abajo hacia arriba y de arriba hacia abajo por cromatografía líquida-ESI-HR-MS es omnipresente y muy superior en muchos aspectos al de arriba hacia abajo por MALDI-TOF-TOF, requieren más tiempo, mano de obra y experiencia. La complejidad de lo...

El análisis e identificación de proteínas no digeridas por espectrometría de masas se conoce como el análisis proteómico de arribahacia abajo 1,2,3,4. Ahora es una técnica establecida que utiliza ionización por electrospray (ESI)5 y analizadores de masa de alta resolución6,y técnicas sofisticadas de disociación, por ejemplo, disociación por transferencia de electrones (ETD), disociación por captura de electrones (ECD)7,fotodesociación ultravioleta (UV-PD)8,etc.
La otra técnica de ionización suave es la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)9,10,11 que se ha utilizado menos ampliamente para el análisis de arriba hacia abajo, en parte porque está acoplada principalmente a analizadores de masa de tiempo de vuelo (TOF), que tienen una resolución limitada en comparación con otros analizadores de masas. A pesar de estas limitaciones, los instrumentos MALDI-TOF y MALDI-TOF-TOF han sido explotados para el análisis rápido de arriba hacia abajo de proteínas puras y mezclas fraccionadas y no fraccionadas de proteínas. Para la identificación de proteínas puras, la desintegración en la fuente (ISD) es una técnica particularmente útil porque permite el análisis de espectrometría de masas (MS) de iones de fragmentos de ISD, así como la espectrometría de masas en tándem (MS / MS) de fragmentos de iones de proteínas que proporcionan fragmentos específicos de secuencia a menudo de los N- y C-termini de la proteína objetivo, análogo a la secuenciación de Edman12,13 . Un inconveniente del enfoque ISD es que, como en la secuenciación de Edman, la muestra debe contener solo una proteína. El único requerimiento de proteína se debe a la necesidad de una atribución inequívoca de iones fragmento a un ion precursor. Si dos o más proteínas están presentes en una muestra, puede ser difícil asignar qué iones fragmento pertenecen a qué iones precursores.
La atribución de iones de fragmentos/iones precursores se puede abordar utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Al igual que con cualquier experimento clásico de MS / MS, los iones precursores se seleccionan en masa / se aíslan antes de la fragmentación, y los iones de fragmento detectados se pueden atribuir a un ion precursor específico. Sin embargo, las técnicas de disociación disponibles para este enfoque se limitan principalmente a la disociación inducida por colisión de alta energía (HE-CID)14 o a la desintegración posterior a la fuente (PSD)15,16. HE-CID y PSD son más eficaces en la fragmentación de péptidos y proteínas pequeñas, y la cobertura de la secuencia puede, en algunos casos, ser limitada. Además, la DSP da como resultado una escisión de la columna vertebral polipeptídica (PBC) principalmente en el lado C-terminal de los residuos de ácido aspártico y glutámico por un fenómeno llamado efecto del ácido aspártico17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS también ha encontrado una aplicación de nicho en la identificación taxonómica de microorganismos: bacterias21,hongos22y virus23. Por ejemplo, los espectros de EM se utilizan para identificar bacterias desconocidas en comparación con una biblioteca de referencia de espectros de EM de bacterias conocidas utilizando algoritmos de reconocimiento de patrones para la comparación. Este enfoque ha demostrado ser muy exitoso debido a su velocidad y simplicidad, aunque requiere un cultivo nocturno del aislado. Los iones proteicos detectados por este enfoque (generalmente por debajo de 20 kDa) comprenden una huella dactilar MS que permite la resolución taxonómica a nivel de género y especie y, en algunos casos, en la subespecie24 y el nivel de cepa25,26. Sin embargo, sigue siendo necesario no solo clasificar taxonómicamente los microorganismos potencialmente patógenos, sino también identificar factores específicos de virulencia, toxinas y factores de resistencia a los antimicrobianos (AMR). Para lograr esto, la masa de péptidos, proteínas o moléculas pequeñas se mide por EM y posteriormente se aísla y fragmenta por EM / EM.
Las bacterias patógenas a menudo transportan piezas circulares de ADN llamadas plásmidos. Los plásmidos, junto con los profagos, son un vector importante de transferencia horizontal de genes entre bacterias y son responsables de la rápida propagación de la resistencia a los antimicrobianos y otros factores de virulencia a través de las bacterias. Los plásmidos también pueden portar genes antibacterianos (AB), por ejemplo, colicina y bacteriocina. Cuando estos genes se expresan y las proteínas se secretan, actúan para desactivar la maquinaria de traducción de proteínas de las bacterias vecinas que ocupan el mismo nicho ambiental27. Sin embargo, estas enzimas bactericidas también pueden representar un riesgo para el huésped que las produjo. En consecuencia, un gen es co-expresado por el huésped que inhibe específicamente la función de una enzima AB y se conoce como su proteína de inmunidad (Im).
Los antibióticos dañinos para el ADN como la mitomicina-C y la ciprofloxacina se utilizan a menudo para inducir la respuesta SOS en la E. coli productora de toxina Shiga (STEC) cuyo gen de la toxina Shiga(stx) se encuentra dentro de un genoma de profagos presente en el genoma bacteriano28. Hemos utilizado previamente la inducción antibiótica, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, y el análisis proteómico de arriba hacia abajo para detectar e identificar tipos y subtipos stx producidos por las cepas STEC29,30,31,32. En el trabajo anterior, la cepa RM7788 de STEC O113:H21 se cultizó durante la noche en medios de agar suplementados con mitomicina-C. Sin embargo, en lugar de detectar la subunidad B anticipada de Stx2a en m/z ~7816, se detectó un ion proteico diferente en m/z ~7839 y se identificó como una proteína hipotética codificada por plásmidos de función desconocida33. En el trabajo actual, identificamos dos proteínas AB-Im codificadas en plásmidos producidas por esta cepa utilizando inducción de antibióticos, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, y análisis proteómico de arriba hacia abajo utilizando un software independiente desarrollado para procesar y escanear secuencias de proteínas in silico derivadas de la secuenciación del genoma completo (WGS). Además, se incorporó al software la posibilidad de modificaciones posteriores a la traducción (PTM) que impliquen truncamiento de secuencia. Las proteínas de inmunidad se identificaron utilizando este software a partir de la masa medida del ion proteína madura y los iones de fragmento específicos de secuencia de PBC causados por el efecto del ácido aspártico y detectados por MS / MS-PSD. Finalmente, se identificó un promotor aguas arriba de los genes AB/Im en un genoma de plásmido que puede explicar la expresión de estos genes cuando esta cepa está expuesta a un antibiótico dañino para el ADN. Partes de este trabajo se presentaron en la Reunión y Exposición Virtual de otoño de 2020 de la National American Chemical Society (17-20 de agosto de 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

Este protocolo identifica las proteínas de inmunidad de las enzimas bactericidas: colicina E3 y bacteriocina, producidas por una cepa patógena de Escherichia coli mediante inducción antibiótica, e identificadas por espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. La proteína de inmunidad de la colicina E3 (Im3) y la proteína de inmunidad de la bacteriocina (Im-Bac) se identificaron a partir de iones prominentes de fragmentos de tipo b y / o y generados por la escisión de la columna vertebral polipeptídica (PBC) en el lado C-terminal del ácido aspártico, el ácido glutámico y los residuos de asparagina por el mecanismo de fragmentación del efecto del ácido aspártico. El software escanea rápidamente secuencias de proteínas in silico derivadas de la secuenciación del genoma completo de la cepa bacteriana. El software también elimina iterativamente los residuos de aminoácidos de una secuencia de proteínas en caso de que la secuencia de proteínas maduras se trunca. Una sola secuencia de proteínas poseía iones de masa y fragmento consistentes con los detectados para cada proteína de inmunidad. La secuencia candidata se inspeccionó manualmente para confirmar que se podían asignar todos los iones de fragmento detectados. La metionina N-terminal de Im3 fue eliminada post-traslacionalmente, mientras que Im-Bac tenía la secuencia completa. Además, encontramos que solo dos o tres iones de fragmentos no complementarios formados por PBC son necesarios para identificar la secuencia de proteínas correcta. Finalmente, se identificó un promotor (caja SOS) aguas arriba de los genes antibacterianos y de inmunidad en un genoma plásmido de la cepa bacteriana.

La Figura 3 (panel superior) muestra el MS de la cepa STEC O113:H21 RM7788 cultivada durante la noche en LBA suplementada con 400 ng/mL de mitomicina-C. Los picos en m/z 7276, 7337 y 7841 se habían identificado previamente como proteína C de choque frío (CspC), proteína de choque frío E (CspE) y una proteína transmitida por plásmidos de función desconocida, respectivamente33. El ion proteína en m/z 9780 [M+H]+ fue analizado por MS/MS-PSD como se mu...

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Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Aquí presentamos un protocolo para la identificación rápida de proteínas producidas por bacterias patógenas secuenciadas genómicamente utilizando espectrometría de masas en tándem MALDI-TOF-TOF y análisis proteómico de arriba hacia abajo con software desarrollado internamente. Los iones proteicos metaestables se fragmentan debido al efecto del ácido aspártico y esta especificidad se explota para la identificación de proteínas.

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

El protocolo demuestra un método rápido para la identificación de proteínas bacterianas mediante inducción antibiótica y espectrometría de masas. La principal ventaja de la técnica es su rapidez y simplicidad. La preparación de la muestra no es complicada.La técnica se puede extender a la caracterización de cualquier bacteria patógena, como los factores de virulencia o la resistencia a los antibióticos para informar mejor el tratamiento adecuado para una infección bacteriana. Para comenzar, use un bucle estéril de un microlitro para cosechar bacterias de colonias individuales cultivadas en placa de agar LB. Y transfiera a un tubo de microcentrífuga de rosca de línea de anillo tórica de dos mililitros que contiene 300 microlitros de agua de grado HPLC.Luego vórtice brevemente el tubo y peletice las células por centrifugación, a un agua reliquia de 0,75 microlitros del sobrenadante de muestra en el objetivo MALDI de acero inoxidable, y deje que se seque. Superponga el punto de muestra seca con 0,75 microlitros de una solución saturada de ácido sinapínico preparada en 33% de acetonitrilo, 67% de agua y 0,2% de ácido trifluoroacético, y deje que la mancha se seque. Una vez que el punto esté seco, cargue el objetivo en el espectrómetro de masas.Abra el software de adquisición y haga clic en MS Linear Mode Acquisition Or mass-to-charge range y mass-to-charge de los límites inferior y superior en sus respectivos campos. Haga clic en el lugar de muestra que se analizará en la plantilla de destino MALDI. A continuación, deprima el botón izquierdo del ratón y arrastre el cursor sobre el punto de muestra para especificar la región rectangular que se muestreará para una ablación o ionización con láser.Suelte el botón del mouse para iniciar la adquisición y recolectar 1000 disparos láser para cada punto de muestra. Si no se detectan iones, aumente la intensidad del láser ajustando la barra de escala móvil bajo la intensidad del láser hasta que se detecte la señal de iones de proteína. Después de completar la adquisición de modo lineal de MS, haga clic en adquisición de modo de ms/ms reflectron.Introduzca la masa precursora que se analizará en el campo Masa precursora. A continuación, introduzca un ancho de aislamiento en daltons en la ventana Masa precursora para el lado de masa baja y alta de la masa precursora. Haga clic en el botón CID Off.A continuación, haga clic en el botón Metastable Suppressor On. Ajuste la intensidad del láser al menos al 90% de su valor máximo ajustando la barra de escala deslizante como se ha demostrado. Haga clic en el punto de muestra que se analizará en la plantilla de destino MALDI, luego deprima el botón izquierdo del mouse y arrastre el cursor sobre el punto de muestra para especificar la región rectangular que se muestreará para la ablación láser o ionización, suelte el botón del mouse para iniciar la adquisición y recopile 10, 000 disparos láser para cada punto de muestra como se demuestra.Haga doble clic en el archivo ejecutable Protein Biomarker Seeker y aparecerá la ventana de la interfaz gráfica de usuario. Introduzca la masa del biomarcador de proteína en el campo masa de proteína madura y el error de medición de masa en el campo de tolerancia de masa. Opcionalmente, haga clic en el botón Calculadora de masa de proteína de iones b/ a de cortesía para calcular la masa de proteínas a partir de un supuesto par de iones de fragmentos complementarios, y aparecerá la ventana emergente de la herramienta Calculadora de masa de proteínas.Ingrese la relación masa-carga del supuesto par de iones de fragmento complementario, haga clic en el botón Agregar par y aparecerá la Calculadora de masa de proteína. Copie y pegue este valor en el campo Masa de proteína madura y cierre la ventana de herramienta Calculadora de masa de proteína. Haga clic en el cuadro Establecer restricción de residuos.Seleccione la longitud del péptido de la señal terminal final, y aparecerá la ventana emergente con una escala deslizante y el cursor y moverá el cursor a la longitud deseada del péptido de la señal. Si no se selecciona la longitud del péptido de señal, el software realizará un truncamiento de secuencia sin restricciones. En la Condición de iones de fragmento, seleccione residuos para la escisión de la columna vertebral de polipéptidos haciendo clic en las casillas de uno o más residuos, D-E-N y / o P.Y luego haga clic en el botón Ingresar iones de fragmento más uno para buscar, y aparecerá la página emergente de fragmentos.A continuación, haga clic en el botón Agregar ion de fragmento y aparecerá un campo desplegable para cada ion de fragmento que se ingrese. Introduzca la masa por relaciones de carga de los iones fragmento y su masa asociada por tolerancia de carga. Luego haga clic en el botón Guardar y cerrar.En el cuadro lateral derecho de Cuántos iones de fragmento deben coincidir, desplácese para seleccionar el número mínimo de iones de fragmento que deben coincidir para su identificación y seleccione los residuos de cisteína en su estado oxidado. Si las proteínas no se identifican después de la búsqueda, repita la búsqueda con cisteínas en su estado reducido. En Configuración de archivo, haga clic en el icono Seleccionar archivo FASTA para examinar y seleccionar el archivo FASTA que contiene las secuencias de proteínas in silico de la cepa bacteriana previamente construida.A continuación, seleccione una carpeta de salida y cree un nombre de archivo de salida. Haga clic en el icono Ejecutar búsqueda en entradas de archivo. Aparecerá una ventana emergente titulada Confirmar parámetros de búsqueda que muestra los parámetros de búsqueda antes de que se inicie la búsqueda.Y si los parámetros de búsqueda son correctos, haga clic en Iniciar búsqueda. Si los parámetros son incorrectos, haga clic en Cancelar y vuelva a introducir los parámetros correctos. Una vez iniciada la búsqueda, la ventana de parámetros se cerrará y aparecerá una nueva ventana emergente con una barra de progreso, que muestra el progreso de la búsqueda y un recuento en ejecución del número de identificaciones encontradas.Al finalizar la búsqueda, la barra de progreso se cerrará automáticamente y se mostrará un resumen de la búsqueda en el campo de registro de la interfaz gráfica de usuario junto con una nueva ventana emergente que muestra las identificaciones de proteínas encontradas. En el estudio actual, se cultivaron cultivos bacterianos en LB con dos concentraciones diferentes de mitomicina-C. El espectro de masas del cultivo bacteriano cultivado con una concentración de mitomicina-C.Se identificaron la proteína de choque frío C, la proteína de choque frío E y una proteína transmitida por plásmidos de función desconocida. El ion proteína desconocido en 9780 fue analizado por MS / MS, y el ion precursor se aisló con una ventana selectora de iones de tiempo de aproximadamente 100 daltons. El fragmento ion en masa a carga 9675.9 es un derrame de la disociación del ion proteína metaestable en 9655.La secuencia de la proteína de inmunidad para la colicina E3 contiene residuos básicos de posibles sitios de ionización. Los iones del fragmento detectados a partir de la escisión de la columna vertebral polipeptídica, cuando se utilizó la forma reducida de cisteína durante la búsqueda. La metionina N-terminal se elimina como una modificación posterior a la traducción.Cuando el cultivo bacteriano se cultivó a una alta concentración de mitomicina-C, se identificó la proteína de inmunidad de la bacteriocina. El pico desconocido en 9651 fue analizado por MS/MS, y el ion precursor se aisló con una ventana TIS más estrecha y asimétrica de menos 75 más 60 daltons. La secuencia de la proteína de inmunidad de la bacteriocina contiene residuos básicos de posibles sitios de ionización.Los iones del fragmento detectados a partir de la escisión de la columna vertebral polipeptídica, cuando se utilizó la forma reducida de cisteína durante la búsqueda. con las diferentes concentraciones de antibióticos, la abundancia relativa de proteínas puede variar. Y estos fueron analizados mediante espectrometría de masas.Al cosechar células bacterianas, observe la morfología de la colonia y el crecimiento bacteriano con respecto a los antibióticos y la concentración. Un bucle de células de un microlitro es necesario para detectar proteínas.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Identificación cualitativa de los ácidos carboxílicos, ácidos bórico y Aminas Utilizando fluoróforos cruciformes

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Investigación

Química

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimización de las proteínas sintéticas: Identificación de interposicional Dependencias de indicación Estructuralmente y / o Residuos Funcionalmente Vinculados

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

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La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

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Rápida de alto rendimiento Identificación de Especies de material botánico Uso del análisis directo en tiempo real de alta resolución Espectrometría de Masas

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

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Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

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Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

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Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro

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