Name: identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

Protein Biomarker Seeker yazılımı, clifton.fagerquist@usda.gov'de Clifton K. Fagerquist ile iletişime geçerek (hiçbir ücret ödemeden) serbestçe kullanılabilir. Ars, USDA, CRIS hibesi: 2030-42000-051-00-D tarafından bu araştırmanın desteğini kabul etmek istiyoruz.

1. Mikrobiyolojik numune hazırlama
<ol><li>Steril 1 μL döngü kullanarak gliserol stoğundan E. coli O113:H21 suşu RM7788 (veya başka bir bakteriyel suş) ile 50 mL konik tüpte 25 mL Luria suyu (LB) aşılanın. Tüpü ve ön kültürü 37 °C'de 4 saat boyunca sallama (200 rpm) ile kapla.</li>
	<li>Aliquot 100 μL önceden kültürlenmiş et suyu ve 400 veya 800 ng/mL mitomycin-C ile desteklenmiş bir LB agar plakasına yayılır. Kültür agar plakaları statik olarak 37 °C'de bir inkübatörde gece b...

Protokolle ilgili önemli noktalar Mevcut protokolün birincil güçlü yönleri hızı, numune hazırlama basitliği ve kullanımı nispeten kolay olan, eğitilen ve bakımı olan bir cihazın kullanımıdır. Sıvı kromatografisi-ESI-HR-MS tarafından yapılan aşağıdan yukarıya ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz her yerde bulunmasına ve MALDI-TOF-TOF tarafından yukarıdan aşağıya doğru birçok açıdan çok daha üstün olmasına rağmen, daha fazla zaman, emek ve uzmanlık gerekti...

Sindirilmemiş proteinlerin kütle spektrometresi ile analizi ve tanımlanması yukarıdan aşağıya proteomik analiz1, 2,3,4olarak adlandırılır. Artık elektrospray iyonizasyon (ESI)5 ve yüksek çözünürlüklü kütle analizörleri6ve elektron transferi ayrışması (ETD), elektron yakalama ayrışması (ECD)7,ultraviyole foto-ayrışma (UV-PD)8,vb.
Diğer yumuşak iyonizasyon tekniği matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI)9,10,11 yukarıdan aşağıya analiz için daha az yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kısmen diğer kütle analizörlerine kıyasla sınırlı çözünürlüğe sahip uçuş zamanı (TOF) kütle analizörleri ile birleştirilmiştir. Bu sınırlamalara rağmen, MALDI-TOF ve MALDI-TOF-TOF cihazları saf proteinlerin ve fraksiyone edilmiş ve kırılmamış protein karışımlarının hızlı yukarıdan aşağıya analizi için yararlanmıştır. Saf proteinlerin tanımlanması için, kaynak içi çürüme (ISD) özellikle yararlı bir tekniktir, çünkü ISD parça iyonlarının kütle spektrometresi (MS) analizine ve ayrıca genellikle hedef proteinin N ve C-terminisinden diziye özgü parça sağlayan protein iyon parçalarının tandem kütle spektrometresine (MS/ MS) izin verir, Edman dizileme12,13'e benzer . ISD yaklaşımının bir dezavantajı, Edman diziliminde olduğu gibi, numunenin yalnızca bir protein içermesi gerektiğidir. Tek protein gereksinimi, parça iyonlarının öncül bir iyona kesin bir şekilde atfedilmesi ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Bir örnekte iki veya daha fazla protein varsa, hangi parça iyonlarının hangi öncül iyonlara ait olduğunu atamak zor olabilir.
Parça iyon/öncül iyon ilişkilendirmesi MALDI-TOF-TOF-MS/MS kullanılarak ele alınabilir. Her klasik MS/MS deneyinde olduğu gibi, öncül iyonlar parçalanmadan önce kitlesel olarak seçilir/izole edilir ve tespit edilen parça iyonları belirli bir öncül iyona bağlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım için mevcut olan ayrışma teknikleri öncelikle yüksek enerjili çarpışma kaynaklı ayrışma (HE-CID)14 veya kaynak sonrası çürüme (PSD)15,16ilesınırlıdır. HE-CID ve PSD en çok peptitlerin ve küçük proteinlerin parçalanmasında etkilidir ve dizi kapsamı bazı durumlarda sınırlı olabilir. Ek olarak, PSD öncelikle aspartik ve glutamik asit kalıntılarının C-terminal tarafında polipeptid omurga bölünmesi (PBC) ile sonuçlanır aspartik asit etkisi17 , 18,19,20.
MALDI-TOF-MS ayrıca mikroorganizmaların taksonomik tanımlamasında niş bir uygulama buldu: bakteri21,mantarlar 22ve virüsler23. Örneğin, MS spektrası, karşılaştırma için desen tanıma algoritmaları kullanarak bilinen bakterilerin MS spektrumlarının bir referans kütüphanesi ile karşılaştırıldığında bilinmeyen bakterileri tanımlamak için kullanılır. Bu yaklaşım, hızı ve basitliği nedeniyle son derece başarılı olmuştur, ancak bir gecede izolenin kültleştirilmesini gerektirmektedir. Bu yaklaşımla tespit edilen protein iyonları (genellikle 20 kDa'nın altında), cins ve tür düzeyinde ve bazı durumlarda alt türler24 ve suş seviyesi 25,26'dataksonomik çözünürlüğe izin sağlayan bir MS parmak izi içerir. Bununla birlikte, sadece taksonomik olarak potansiyel patojenik mikroorganizmaları sınıflandırmakla kalmayıp, aynı zamanda spesifik virülans faktörlerini, toksinleri ve antimikrobiyal direnç (AMR) faktörlerini de tanımlamaya ihtiyaç vardır. Bunu başarmak için peptitlerin, proteinlerin veya küçük moleküllerin kütlesi MS ile ölçülür ve daha sonra MS/MS tarafından izole edilir ve parçalanır.
Patojenik bakteriler genellikle plazmid adı verilen dairesel DNA parçaları taşırlar. Plazmidler, profilaktasyonlarla birlikte, bakteriler arasında yatay gen transferinin önemli bir vektörüdür ve antimikrobiyal direncin ve diğer virülans faktörlerinin bakteriler arasında hızla yayılmasından sorumludur. Plazmidler ayrıca kolitin ve bakteriyotin gibi antibakteriyel (AB) genler de taşıyabilir. Bu genler ifade edildiğinde ve proteinler salgılandığında, aynı çevresel niş işgal komşu bakterilerin protein çeviri makinelerini devre dışı bırakmak için hareket ederler27. Bununla birlikte, bu bakterisidal enzimler, onları üreten konak için de risk oluşturabilir. Sonuç olarak, bir gen, özellikle bir AB enziminin işlevini engelleyen ve bağışıklık proteini (Im) olarak adlandırılan konak tarafından birlikte ifade edilir.
Mitomycin-C ve sirofloksasin gibi DNA'ya zarar veren antibiyotikler genellikle Shiga toksin üreten E. coli'de (STEC) SOS yanıtını teşvik etmek için kullanılır, shiga toksin geni(stx) bakteri genomunda bulunan bir prophage genomunda bulunur28. Daha önce STEC suşları29,30, 31,32 tarafından üretilen Stx tiplerini ve alt tiplerini tespit etmek ve tanımlamak için antibiyotik indüksiyonu, MALDI-TOF-TOF-MS / MS ve yukarıdan aşağıyaproteomikanalizkullandık. Önceki çalışmada, STEC O113:H21 suşu RM7788, mitomycin-C ile desteklenmiş agar media üzerinde bir gecede kültürlendi. Bununla birlikte, m/z ~7816'da Stx2a'nın beklenen B-alt birliğini tespit etmek yerine, m/z ~ 7839'da farklı bir protein iyonu tespit edildi ve bilinmeyen işlev33plazmid kodlu varsayımsal protein olarak tanımlandı. Mevcut çalışmada, antibiyotik indüksiyonu kullanılarak bu suş tarafından üretilen iki plazmid kodlu AB-Im proteini, MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz, tam genom diziliminden (WGS) elde edilen siliko protein dizilerini işlemek ve taramak için geliştirilen bağımsız yazılım kullanılarak tespit ettik. Buna ek olarak, sıralı kesilmeyi içeren çeviri sonrası değişiklikler (PTM) olasılığı yazılıma dahil edildi. Bağışıklık proteinleri, aspartik asit etkisinin neden olduğu ve MS/MS-PSD tarafından tespit edilen PBC'den olgun protein iyonunun ve diziye özgü parça iyonlarının ölçülen kütlesinden bu yazılım kullanılarak tanımlanmıştır. Son olarak, bu suş DNA'ya zarar veren bir antibiyotiğe maruz kaldığında bu genlerin ekspresyonunu açıklayabilecek bir plazmid genomda AB / Im genlerinin yukarı akışında bir promotör tespit edildi. Bu çalışmanın bazı bölümleri National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo'da (17-20 Ağustos 2020)34.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4000 Series Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 3.5.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A996-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL-2 biohazard cabinet</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>SG403A-HE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome-C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2867-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Explorer software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Version 4.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Focus Protein Reduction-Alkylation kit</td>
			<td>G-Biosciences</td>
			<td>786-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPMAW software</td>
			<td>Lighthouse Data</td>
			<td>Version 10.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9120973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSpin Plus Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin-C (from streptomyces)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0440-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myoglobin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5696-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker MaxQ 420HP Model 420</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinapinic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1861580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1 uL loops</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioredoxin (E. coli, recombinant)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0910-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/MS grade</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>W6-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of antibacterial immunity proteins in escherichia coli using maldi-tof-tof-ms/ms and top-down proteomic analysis

Bu protokol bakterisidal enzimlerin bağışıklık proteinlerini tanımlar: antibiyotik indüksiyonu kullanılarak patojenik bir Escherichia koli suşu tarafından üretilen ve MALDI-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz ile şirket içinde geliştirilen yazılımla tanımlanan kolisin E3 ve bakteriyosin. Kolisin E3 (Im3) bağışıklık proteini ve bakteriyosin (Im-Bac) bağışıklık proteini, kuşkonmaz asit, glutamik asit ve kuşkonmaz kalıntılarının C-terminal tarafındaki polipeptid omurga bölünmesi (PBC) tarafından üretilen belirgin b ve/veya y tipi parça iyonlarından kuşkonmaz asit etkisi parçalanma mekanizması ile tanımlanmıştır. Yazılım, bakteri suşunun tüm genom diziliminden elde edilen siliko protein dizilerini hızla tarar. Yazılım ayrıca olgun protein dizisinin kesilmesi durumunda bir protein dizisinin amino asit kalıntılarını yinelemeli olarak giderir. Tek bir protein dizisi, her bağışıklık proteini için tespit edilenlerle tutarlı kütle ve parça iyonlarına sahipti. Aday sırası daha sonra algılanan tüm parça iyonlarının atanabileceğini onaylamak için el ile denetlendi. Im3'ün N-terminal metiyoni çeviri sonrası kaldırılırken, Im-Bac tam sıraya sahipti. Ek olarak, doğru protein dizisini tanımlamak için PBC tarafından oluşturulan sadece iki veya üç tamamlayıcı olmayan parça iyonlarının gerekli olduğunu gördük. Son olarak, bakteriyel suşun plazmid genomunda antibakteriyel ve bağışıklık genlerinin yukarı akışta bir promotör (SOS kutusu) tespit edildi.

Şekil 3 (üst panel), 400 ng/mL mitomycin-C ile desteklenmiş LBA'da bir gecede kültürlenen STEC O113:H21 suşu RM7788'in MS'ini göstermektedir. M/z 7276, 7337 ve 7841'deki zirveler daha önce sırasıyla soğuk şok proteini C (CspC), soğuk şok proteini E (CspE) ve plazmid kaynaklı bilinmeyen bir proteinolaraktanımlanmıştı. m/z 9780 [M+H]+ protein iyonu Şekil 3'te (alt panel) gösterildiği gibi MS/MS-PSD tarafınd...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis at JoVE.com

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Protokol, antibiyotik indüksiyonu ve kütle spektrometresi kullanılarak bakteriyel proteinlerin tanımlanması için hızlı bir yöntem göstermektedir. Tekniğin ana avantajı hız ve basitliktir. Numune hazırlama karmaşık değildir.Teknik, bakteriyel bir enfeksiyon için uygun tedaviyi daha iyi bilgilendirmek için virülans faktörleri veya antibiyotik direnci gibi herhangi bir patojenik bakterinin karakterizasyonuna kadar genişletilebilir. Başlamak için, LB agar plakasında yetişen tek kolonilerden bakteri toplamak için steril bir mikroliter döngüsü kullanın. Ve 300 mikrolitre HPLC sınıfı su içeren iki mililitrelik O-ring halka hattı vida kapağı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, Paslanmaz Çelik MALDI Hedefi üzerindeki numune süpernatantının 0,75 mikroliter kalıntı suyunda tüpü kısaca girdaplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın ve kurumasını bekleyin. Kurutulmuş numune noktasını%33 asetonitril, %67 su ve %0,2 trifluoroasetik asitte hazırlanan doymuş bir sinapinik asit çözeltisinin 0,75 mikrolitresi ile kaplayın ve noktanın kurumasını bekleyin. Nokta kuruduktan sonra hedefi kütle spektrometresi içine yükleyin.Edinme yazılımını açın ve MS Doğrusal Mod Alma veya yığından şarj aralığına ve alt ve üst sınırların kendi alanlarına toplu şarjına tıklayın. MALDI hedef şablonunda analiz edilecek örnek noktaya tıklayın. Ardından sol fare düğmesini basılın ve lazer ablasyon veya iyonlaşma için örneklenecek dikdörtgen bölgeyi belirtmek için imleci örnek noktanın üzerine sürükleyin.Satın almayı başlatmak ve her örnek nokta için 1000 lazer çekimi toplamak için fare düğmesini bırakın. İyonlar tespit edilirse, protein iyon sinyali tespit edilene kadar lazer yoğunluğu altında kayan ölçek çubuğunu ayarlayarak lazer yoğunluğunu arttırır. MS Doğrusal Mod Alımı tamamlandıktan sonra, MS/MS Yansıtma Modu Alımı'nı tıklatın.Öncü Kitle alanına analiz edilecek öncül kütleyi girin. Ardından, öncül kütlenin düşük ve yüksek kütleli tarafı için Öncü Kütle penceresindeki daltonlara bir izolasyon genişliği girin. CID Kapalı düğmesini tıklatın.Ardından Metastable Suppressor On düğmesini tıklatın. Gösterilen gibi kayar ölçek çubuğunu ayarlayarak lazer yoğunluğunu maksimum değerinin en az %90'ına ayarlayın. MALDI hedef şablonunda analiz edilecek örnek noktaya tıklayın, ardından sol fare düğmesini basılın ve lazer ablasyon veya iyonizasyon için örneklenecek dikdörtgen bölgeyi belirtmek için imleci örnek noktanın üzerine sürükleyin, alımı başlatmak için fare düğmesini bırakın ve gösterildiği gibi her örnek nokta için 10.000 lazer çekimi toplayın.Protein Biomarker Arayıcı Yürütülebilir Dosyası'nı çift tıklatır ve grafik kullanıcı arabirimi penceresi görünecektir. Olgun Protein Kütlesi alanına protein biyobelirtecinin kütlesini ve Kütle Toleransı alanına kütle ölçüm hatasını girin. İsteğe bağlı olarak, protein kütlesini putatif ücretsiz parça iyon çiftinden hesaplamak için Ücretsiz b/y iyon Protein Kütle Hesaplayıcısı düğmesine tıklayın ve Protein Kütle HesaplayıcıSı Aracı'nın açılır penceresi görünecektir.Putatif ücretsiz parça iyon çiftinin şarj oranını şarj etmek için kütleyi girin, Çift Ekle düğmesine tıklayın ve Hesap Makinesi Protein Kütlesi görünecektir. Bu değeri Olgun Protein Kütlesi alanına kopyalayın ve Protein Kütle Hesaplayıcısı araç penceresini kapatın. Kalıntı Kısıtlamasını Ayarla kutusunu tıklatın.Uç terminal sinyal peptit uzunluğunu seçin ve kayar bir ölçek ve imleç içeren açılır pencere görünecek ve imleci istenen sinyal peptit uzunluğuna taşıyacaktır. Sinyal peptit uzunluğu seçilmezse, yazılım tarafından sınırsız bir sıra kesilmesi gerçekleştirilir. Parça İyon Koşulu altında, bir veya daha fazla kalıntı, D-E-N ve/veya P kutularına tıklayarak Polipeptid Omurga Bölünmesi için Kalıntılar'ı seçin ve ardından arama yapmak için Parça İyonları Artı Bir Girin düğmesine tıklayın ve açılır parça sayfası görünecektir.Daha sonra Parça İyon Ekle düğmesine tıkladiğinizde, girilecek her parça iyon için bir açılan alan görünecektir. Parça iyonlarının yük oranlarına ve ilgili kütlelerine göre yük toleransı ile kütleyi girin. Ardından Kaydet ve Kapat düğmesine tıklayın.Kaç Parça İyonunun Eşleşmesi Gerekiyor'un sağ yan kutusunda, tanımlama için eşleşmesi gereken en az parça iyon sayısını seçmek için kaydırın ve oksitlenmiş durumlarındaki sistein kalıntılarını seçin. Proteinler aramadan sonra tanımlanmazsa, aramayı azaltılmış hallerinde sisteinlerle tekrarlayın. Dosya Kurulumu altında, daha önce oluşturulmuş bakteri türünün siliko protein dizilerini içeren FASTA dosyasına göz atmak ve seçmek için FASTA dosyasını seç simgesine tıklayın.Ardından bir çıktı klasörü seçin ve bir çıktı dosyası adı oluşturun. Dosya Girişlerinde Aramayı Çalıştır simgesini tıklatın. Arama başlatılmadan önce arama parametrelerini görüntüleyen Arama Parametrelerini Onayla başlıklı bir açılır pencere görüntülenir.Arama parametreleri doğruysa Aramaya Başla'yı tıklatın. Parametreler yanlışsa, İptal'i tıklatın ve doğru parametreleri yeniden girin. Arama başlatıldıktan sonra parametre penceresi kapanır ve aramanın ilerlemesini ve bulunan kimlik sayısının çalışan bir çetelesini gösteren ilerleme çubuğuna sahip yeni bir açılır pencere görüntülenir.Arama tamamlandıktan sonra, ilerleme çubuğu otomatik olarak kapatılacak ve aramanın bir özeti, bulunan protein kimliklerini görüntüleyen yeni bir açılır pencere ile birlikte grafik kullanıcı arabiriminin günlük alanında görüntülenecektir. Mevcut çalışmada, LB'de iki farklı mitomycin-C konsantrasyonu ile bakteri kültürleri yetiştirildi. Bakteri kültürünün kütle spektrumu mitomycin-C konsantrasyonu ile büyüdü.Soğuk şok proteini C, soğuk şok proteini E ve plazmid kaynaklı, fonksiyonu bilinmeyen bir protein tanımlanmıştır. 9780'de bilinmeyen protein iyonu MS/MS tarafından analiz edildi ve öncül iyon yaklaşık 100 daltonluk bir zaman iyon seçici penceresi ile izole edildi. Kütledeki parça iyonu 9675.9'a kadar olan kütle, 9655'teki metastable protein iyonunun ayrışmasıyla dökülür.Kolin E3 için bağışıklık proteininin dizilimi, temel kalıntı olası iyonlaşma alanlarını içerir. Arama sırasında sistein formunun azalmasıyla polipeptid omurga bölünmesinden tespit edilen parça iyonları. N-terminal methionine çeviri sonrası değişiklik olarak kaldırılır.Bakteri kültürü yüksek mitomycin-C konsantrasyonda yetiştirildiğinde, bakteriyosinin bağışıklık proteini tanımlanmıştır. 9651'deki bilinmeyen zirve MS/MS tarafından analiz edildi ve öncü iyon eksi 75 artı 60 daltonluk daha dar ve asimetrik bir Tİs penceresi ile izole edildi. Bakteriyosinin bağışıklık proteininin dizilimi, olası iyonlaşma bölgelerinde temel kalıntılar içerir.Arama sırasında sistein formunun azalmasıyla polipeptid omurga bölünmesinden tespit edilen parça iyonları. farklı antibiyotik konsantrasyonları ile, göreceli protein bolluğu değişebilir. Ve bunlar kütle spektrometresi kullanılarak analiz edildi.Bakteri hücrelerini toplarken, antibiyotikler ve konsantrasyon açısından koloni morfolojisini ve bakteri üremesini gözlemleyin. Proteinleri tespit etmek için bir mikroliter hücre döngüsü gereklidir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Qualitative Identification of Carboxylic Acids, Boronic Acids, and Amines Using Cruciform Fluorophores

Karboksilik Asitler, Boronik Asitler ve Aminler nitel Kimlik haç fluorophores kullanarak

Molecular cruciforms are X-shaped systems in which two conjugation axes intersect at a central core. If one axis of these molecules is substituted with ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Sentetik Proteinlerin Optimizasyon: interpozisyonel bağımlılıklar belirlenmesi Yapısal belirten ve / veya Fonksiyonel Bağlantılı tortular

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Gerçek Zamanlı Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometresi Doğrudan Analizi Kullanılarak Botanik Malzeme Hızlı Yüksek verim Türler Kimlik

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Bitki Doku Organik Asit belirlememize Kılcal Elektroforez kullanma: Bir Test Case incelenmesi<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Tohumlar

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...