Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Dette arbejde støttes delvist af R01HL139796 og R01HL128847 tilskud til CKB og RO1DE028297 og CBET1608058 til DWM.

Brugen af dyr i denne undersøgelse var i overensstemmelse med Landsdækkende Children's Hospital institutionelle dyrepleje og brug udvalg under protokol AR13-00030.
1. Pulmonary ventil excision
<ol><li>Autoklaver de nødvendige værktøjer, der er nødvendige for musens dissektion. Dette omfatter fin saks, mikro pincet, mikro vaskulære klemmer, klemme anvende pincet, microneedle indehavere, fjeder saks, og retractorer.</li>
	<li>Akklimatisere alle mus i mindst 2 uger før operationen. Fjer...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

Fjernelse af hjertekamrene tjener to formål. For det første udsætte ventrikelsiden for det atmosfæriske tryk og derved kun behøver at anvende et transvalvulartryk frapulsventilens arterielle side for at lukke, og for det andet at give en stabil base for at forhindre vridning af lungestammen. Under tryk spredes lungestammen radialt og ringere, hvilket gør den tilbøjelig til at vride, hvilket forårsager lungestammens sammenbrud. Forbelastning af lungeventilen med en saltvandsopløsning giver et ekstra kvalitetskont...

Lungeventilen (PV) tjener til at sikre ensrettet blodgennemstrømning mellem højre hjertekammer og lungepulsåren. Lungeventil misdannelser er forbundet med flere former for medfødt hjertesygdom. Den nuværende behandling for medfødt hjerteklap sygdom (HVD) er valvular reparation eller ventil udskiftning, som kan nødvendiggøre flere invasive operationer i hele en patients levetid1. Det er almindeligt accepteret, at hjerteklapperens funktion er afledt af dens struktur, ofte omtalt som strukturfunktionen korrelerer. Mere specifikt dikterer hjertets geometriske og biomekaniske egenskaber dets funktion. De mekaniske egenskaber bestemmes igen af ECM's sammensætning og organisation. Ved at udvikle en metode til bestemmelse af murine hjerteklappers biomekaniske egenskaber kan transgene dyremodeller bruges til at afhøre ECM's rolle på hjerteklapfunktion og dysfunktion2,3,4,5.
Den murindyrsmodel har længe været betragtet som standarden for molekylære undersøgelser, fordi transgene modeller er lettere tilgængelige hos mus sammenlignet med andre arter. Murine transgene modeller giver en alsidig platform til forskning i hjerteklap-relaterede sygdomme6. Men den kirurgiske ekspertise og instrumentering krav til at karakterisere både geometri og ECM organisation har været en stor forhindring i udviklingen af HVD forskning. Hstological data i litteraturen giver et billede i murine hjerteklap ekstracellulær matrix indhold, men kun i form af 2D-billeder, og er ude af stand til at beskrive sin 3D arkitektur7,8. Derudover er hjerteklapen både rumligt og tidsmæssigt heterogen, hvilket gør det vanskeligt at drage konklusioner på tværs af eksperimenter vedrørende ECM-organisation, hvis prøveudtagningen og kropsbygningen ikke er fast. Konventionelle 3D-karakteriseringsmetoder,f.eks.
Dette arbejde beskriver en fuldt korrelativ arbejdsgang, hvor den tidsmæssige heterogenitet på grund af hjertecyklussen blev behandlet ved at fastgøre kropsbygning af murine PV med hydrostatisk transvalvular tryk. Den rumlige heterogenitet blev kontrolleret præcist af stikprøver af interesseområder og registrering af datasæt fra forskellige billeddannelsesmetoder, navnlig μCT og seriel blokscanning af elektronmikroskopier på tværs af forskellige længdeskalaer. Denne metode til scouting med μCT til styring af downstream-prøveudtagning er tidligere blevet foreslået, men fordi lungeventilen udviser tidsvariation, var der behov for et ekstra kontrolniveau på det kirurgiske niveau11.
In vivo-undersøgelser, der beskriver murin hjerteklapbiomekanik, er sparsomme og er i stedet afhængige af beregningsmodeller, når de beskriver deformationsadfærden. Det er af afgørende betydning, at lokale ekstracellulære data på nanometerlængdeskalaen relateres til hjerteklapperens geometri og placering. Dette giver igen kvantificerbare, rumligt kortlagte fordelinger af mekanisk bidragende ECM-proteiner, som kan bruges til at styrke eksisterende biomekaniske hjerteklapmodeller12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

De underliggende årsager til hjerteklap relateret sygdom (HVD) er undvigende. Murine dyremodeller giver et glimrende værktøj til at studere HVD, men den kirurgiske og instrumentale ekspertise, der kræves for præcist at kvantificere strukturen og organisationen på tværs af flere længdeskalaer, har hæmmet dens fremskridt. Dette arbejde giver en detaljeret beskrivelse af murine dissektion, en bloc farvning, prøve behandling, og korrelative billeddannelse procedurer for skildring af hjerteklap på forskellige længde skalaer. Hydrostatisk transvalvulartryk blev brugt til at kontrollere den tidsmæssige heterogenitet ved kemisk fastsættelse af hjerteklap kropsbygning. Mikrocomputertomografi (μCT) blev brugt til at bekræfte hjerteklapperens geometri og give en reference til den downstream-prøvebehandling, der er nødvendig for den serielle blok ansigtsscanningselektronmikroskopi (SBF-SEM). Seriel SEM-billeder i høj opløsning af den ekstracellulære matrix (ECM) blev taget og rekonstrueret for at give en lokal 3D-repræsentation af organisationen. μCT- og SBF-SEM-billeddannelsesmetoder blev derefter korreleret for at overvinde den rumlige variation på tværs af lungeventilen. Selv om det præsenterede arbejde udelukkende er på lungeventilen, kan denne metode anvendes til at beskrive den hierarkiske organisation i biologiske systemer og er afgørende for den strukturelle karakterisering på tværs af flere længdeskalaer.

Anastomose i lungepulsåren til slangen under tryk er vist i figur 1A. Efter anvendelse af hydrostatisk tryk udsender lungestammen radialt (figur 1B), hvilket indikerer, at lungeventilfolderne er i lukket konfiguration. Lungeventilens kropsbygning blev bekræftet af μCT. I dette tilfælde var folderne koapt (lukket), og annulus var cirkulære (figur 2A). Figur 2B,C viser varierende gra...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Her beskriver vi en korrelativ arbejdsgang for excision, tryk, fiksering og billeddannelse af murinepulmonalventilen for at bestemme bruttokonformationen og lokale ekstracellulære matrixstrukturer.

Kirurgi og prøvebehandling for korrelerativ billeddannelse af Murine lungeventilen

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Denne protokol er vigtig, fordi den er designet til at besvare spørgsmål om strukturfunktionen korrelere af murinepulmonalventilen, hvilket generelt er vanskeligt på grund af dens iboende heterogenitet. Den kontrollerede fiksering og korrelative billeddannelse blev brugt til at fange strukturen på flere længdeskalaer. Lokale billeder i høj opløsning kan derefter kortlægges tilbage til den nøjagtige anatomiske placering på lungeventilen.Demonstration af proceduren vil blive Dr.Tai Yi, direktør for mikrokirurgi i Center for Regenerativ Medicin på Landsdækkende Children's Hospital. Begynd med autoklavering af de værktøjer, der er nødvendige for musens dissektion, herunder fin saks, mikroforceps, mikrovaskulære klemmer, klemme applying pincet, microneedle indehavere, fjeder saks, og retractorer. Efter aflivning af en voksen C57BL/6 mus, skal du placere den i en dorsal liggende position på en bakke, fastgør sine lemmer med tape og udfør thoracotomien.Udsæt hjertet ved at fjerne overskydende fedtvæv og fascia, fjern derefter højre atrium og perfuse venstre ventrikel med stuetemperatur saltvandsopløsning. Fjern hele hjertet ved at afskære den overlegne vena cava, ringere vena cava, lungearterie og aorta, og skær cirka to millimeter over ventriculoatrial krydset, som vil tjene som kanal for tryk. Fjern venstre og højre hjertekamre for at udsætte kamrene for atmosfærisk tryk, hvilket sikrer, at lungestammestrukturen ikke påvirkes ved at fjerne ventriklerne.Anastomose trykslanger med lungepulsåren, hvilket efterlader ca. en millimeter afstand mellem sinotubular krydset og enden af slangen for at imødekomme store bevægelser af foldere og lungestamme. Løft reservoiret til et tilsvarende fysiologisk tryk og fyld det med saltvandsopløsningen. Test gennemstrømningssystemet for at sikre, at der ikke er blokeringer eller luftbobler.Fastgør en stophane til den anastomosed lungeventil og sørg for tilstrækkelig strøm gennem slangen ved at skifte udstrømningskanalen. Når strømmen er tilstrækkelig, skal du skifte udstrømningen til den antomoserede lungeventil og sikre tryk på lungestammen identificeret ved trunk distension. Efter at have bekræftet trykningen af lungestammen, skal du gradvist indarbejde primær fiksativ opløsning, indtil 25% af saltvandsopløsningens reservoirkapacitet er renset.Placer en fiksativ-gennemblødt gaze over vævsprøven for at forhindre tørring. Gennemtræld fikseringsstativet i tre timer, genopfyldning af reservoiret for at opretholde et konstant tryk. Efter perfusion opbevares hjerteklapen i fikseringsopløsningen ved fire grader Celsius, indtil den bruges i op til en uge.Til farvning vaskes den faste hjerteklapprøve tre gange med kold 0,15 molarkacylatbuffer i fem minutter og nedsænkes fuldstændigt hjerteklap i en opløsning på 1,5 kaliumferrocyanid, 0,15 molarkakodilat, to millimolar calciumchlorid og 2%osmium tetroxid på is i en time. Vask prøverne med stuetemperatur dobbelt destilleret vand ved at placere dem i et rør i fem minutter med let omrøring. Efter yderligere tre vaske skal prøven anbringes i filtreret thiocarbohydrazidopløsning ved stuetemperatur.Efter 20 minutter vaskes prøven tre gange med vand som påvist tidligere. Derefter anbringes prøven i 2%osmium tetroxid ved stuetemperatur. Efter 30 minutter vaskes det med vand tre gange i fem minutter hver og inkuberes prøven i 1%uranylacetat natten over ved fire grader Celsius.I mellemtiden forberede en opløsning af blynitrat. Den følgende dag skal du udføre vasketrinnet tre gange som påvist tidligere og derefter inkubere hjerteklapvævet i bly aspartatopløsning ved 60 grader Celsius i 30 minutter. Vask prøverne tre gange mere, og udfør derefter en seriel dehydreringsbehandling på hjerteklapvævene med frisklavet 20, 50, 70 og 90% ethanol på is i fem minutter hver, efterfulgt af to efterfølgende behandlinger med 100% ethanol.Efter dehydrering skal du flytte vævene til iskold acetone og derefter placere det i frisk acetone ved stuetemperatur i 10 minutter. Til indlejring skal du lave harpiksblandingen i henhold til producentens specifikationer. Placer væv i efterfølgende behandlinger af 25 til 75, 50 til 50 og 75 til 25 harpiks til acetone blanding i to timer hver.Endelig skal du placere vævene i 100% harpiks natten over. Den følgende dag placeres væv i frisk 100% harpiks. Efter to timer overføres vævene til en indlejringskapsel, tilsæt frisk 100% harpiks og læg den i en 60 grader Celsius ovn i 48 timer for at helbrede.Den punkterede anastomosed lungepulsåre før og efter påføring af hydrostatisk tryk er vist her. Lungestammen udsender radialt, hvilket indikerer, at lungeventilfolderne er i en lukket konfiguration. Mikrokomputtomografi bekræftede bekræftelsen af lungeventilen.Folderne blev lukket, og annulus var cirkulære, mens varierende grader af utilstrækkelig lungeventil tryk ved enten fiksering eller arteriel sammenbrud blev observeret. Mikro-CT-volumengengivelsen af virtuelle tværsnit var korreleret med optiske billeder for at bekræfte udskæringsretningen og placeringen. SBF SEM-billeder i høj opløsning blev taget i en lokal region i en folder, da prøveblokken var på det ønskede sted og den ønskede retning.Korrelerede billeder mellem mikro-CT-diskenheden, der gengiver virtuelle udsnit, SBF SEM-billeder med lav opløsning og høj opløsning, vises her. I 3D repræsentation af et segmenteret område af lungeventilen, ekstracellulære komponenter som endotelceller, valvular interstitielle celler, og ekstracellulære fibre kan identificeres. Når du forsøger denne protokol, skal du huske på, at det er vigtigt at udføre trykningen, og vil sikre, at udbyttet er så højt som muligt.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Solid-state podningscopolymer Elektrolytter for lithium batteri applikationer

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Rumlig adskillelse af molekylære konformatorer og klynger

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Hurtig Imaging teknik til at undersøge Drop Impact Dynamics af ikke-newtonske væsker

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Electron Kanalisering Contrast Imaging til Rapid III-V Heteroepitaxial Karakterisering

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Anvendelse af en Multi-rum Dynamic Single Enzyme Phantom for Studier af Hyperpolariserede Magnetic Resonance Agenter

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Fugtspredende Tests for ensrettet Fabrics: Målinger af Kapillær Parametre til Vurdere kapillartryk i Liquid Composite støbeprocesser

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Behandling af Bulk Nanocrystalline metaller ved US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Retningslinjer og erfaring med at bruge Imaging biomarkør Explorer (IBEX) for Radiomics

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Sammenvoksede glødetrådens fabrikation (FFF) af Metal-keramisk komponenter

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Fremstilling af nanohøjdekanaler med Surface Acoustic Wave-aktivering via lithiumniobat til akustisk nanofluidics

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...