Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door R01HL139796 en R01HL128847 subsidies aan CKB en RO1DE028297 en CBET1608058 voor DWM.

Het gebruik van dieren in deze studie was in overeenstemming met de landelijke commissie voor de verzorging en het gebruik van dieren in het Kinderziekenhuis volgens protocol AR13-00030.
1. Pulmonale klep excisie
<ol><li>Autoclaaf de benodigde tools die nodig zijn voor de muisdissectie. Dit omvat fijne scharen, micro-forceps, micro vasculaire klemmen, klem aanbrengende tang, microneedle houders, veerschaar en oprolmechanismen.</li>
	<li>Acclimatiseren alle muizen gedurende minimaal 2 weken v...

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

Verwijdering van de ventrikels dient twee doeleinden. Ten eerste, het blootstellen van de ventrikelzijde aan de atmosferische druk, waardoor alleen een transvalvulaire druk van de arteriële kant van de longklep hoeft te worden uitgeoefend om te sluiten, en ten tweede, het verstrekken van een stabiele basis om verdraaiing van de longstam te voorkomen. Tijdens drukopzetting disteneert de longstam radiaal en inferieur, waardoor deze gevoelig is voor verdraaiing, waardoor de longstam instort. Het voorladen van de longklep m...

De longklep (PV) dient om eenrichtingsbloeding tussen de rechterventrikel en de longslagader te garanderen. Longklepmisvormingen worden geassocieerd met verschillende vormen van aangeboren hartaandoeningen. De huidige behandeling voor aangeboren hartklepziekte (HVD) is valvulaire reparatie of klepvervanging, die meerdere invasieve operaties gedurende de hele levensduur van een patiënt kan vereisen1. Het is algemeen aanvaard dat de functie van de hartklep is afgeleid van de structuur, vaak aangeduid als de structuur-functie correleren. Meer specifiek bepalen de geometrische en biomechanische eigenschappen van het hart zijn functie. De mechanische eigenschappen worden op hun beurt bepaald door de samenstelling en organisatie van de ECM. Door een methode te ontwikkelen voor het bepalen van de biomechanische eigenschappen van muriene hartkleppen, kunnen transgene diermodellen worden gebruikt om de rol van het ECM op de hartklepfunctie en disfunctie2,3,4,5te ondervragen.
Het muriene diermodel wordt al lang beschouwd als de standaard voor moleculaire studies omdat transgene modellen gemakkelijker beschikbaar zijn bij muizen in vergelijking met andere soorten. Murine transgene modellen bieden een veelzijdig platform voor het onderzoeken van hartklep-gerelateerde ziekten6. De chirurgische expertise en instrumentatievereisten om zowel de geometrie als de ECM-organisatie te karakteriseren, zijn echter een belangrijke hindernis geweest bij het voortgang van HVD-onderzoek. Hstologische gegevens in de literatuur geven een beeld van het extracellulaire matrixgehalte van de muriene hartklep, maar alleen in de vorm van 2D-afbeeldingen, en kunnen de 3D-architectuur7,8niet beschrijven . Bovendien is de hartklep zowel ruimtelijk als tijdelijk heterogeen, waardoor het moeilijk is om conclusies te trekken over experimenten met betrekking tot ECM-organisatie als de bemonstering en exterieur niet vastliggen. Conventionele 3D-karakteriseringsmethoden, zoals MRI of 3D-echocardiografie, bieden niet de resolutie die nodig is om ECM-componenten9,10op te lossen .
Dit werk beschrijft een volledig correlatieve workflow waarbij de temporele heterogeniteit als gevolg van de hartcyclus werd aangepakt door de conformatie van de muriene PV met hydrostatische transvalvulaire druk vast te stellen. De ruimtelijke heterogeniteit werd nauwkeurig gecontroleerd door bemonsteringsgebieden van belang en het registreren van datasets van verschillende beeldvormende modaliteiten, met name μCT en seriële blok gezichtsscan elektronenmicroscopie, over verschillende lengteschalen. Deze methode van scouting met μCT voor het begeleiden van downstreambemonstering is eerder voorgesteld, maar omdat de longklep temporele variatie vertoont, was een extra niveau van controle nodig op chirurgisch niveau11.
In vivo studies die muriene hartklepbiomechanica beschrijven, zijn schaars en vertrouwen in plaats daarvan op rekenmodellen bij het beschrijven van het vervormingsgedrag. Het is van cruciaal belang dat lokale extracellulaire gegevens op de nanometerlengteschaal verband houden met de geometrie en locatie van de hartklep. Dit biedt op zijn beurt kwantificeerbare, ruimtelijk in kaart gebrachte distributies van mechanisch bijdragende ECM-eiwitten, die kunnen worden gebruikt om bestaande biomechanische hartklepmodellen12,13,14te versterken .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

De onderliggende oorzaken van hartklepgerelateerde ziekte (HVD) zijn ongrijpbaar. Murine diermodellen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van HVD, maar de chirurgische en instrumentale expertise die nodig is om de structuur en organisatie nauwkeurig te kwantificeren over meerdere lengteschalen heeft de vooruitgang belemmerd. Dit werk biedt een gedetailleerde beschrijving van de muriene dissectie, en bloc kleuring, monsterverwerking en correlatieve beeldvormingsprocedures voor het weergeven van de hartklep op verschillende lengteschalen. Hydrostatische transvalvulaire druk werd gebruikt om de temporele heterogeniteit te beheersen door de hartklepconformatie chemisch te bevestigen. Micro-computertomografie (μCT) werd gebruikt om de geometrie van de hartklep te bevestigen en een referentie te geven voor de downstream monsterverwerking die nodig is voor de seriële blokkoping elektronenmicroscopie (SBF-SEM). Seriële SEM-beelden met hoge resolutie van de extracellulaire matrix (ECM) werden genomen en gereconstrueerd om een lokale 3D-weergave van de organisatie te bieden. μCT- en SBF-SEM-beeldvormingsmethoden werden vervolgens gecorreleerd om de ruimtelijke variatie over de longklep te overwinnen. Hoewel het gepresenteerde werk uitsluitend op de longklep is, kan deze methodologie worden gebruikt voor het beschrijven van de hiërarchische organisatie in biologische systemen en is cruciaal voor de structurele karakterisering over meerdere lengteschalen.

Anastomose van de longslagader naar de drukslang is weergegeven in figuur 1A. Na het toepassen van hydrostatische druk distent de longstam radiaal (figuur 1B) wat aangeeft dat de longklepbijsluiters zich in een gesloten configuratie bevinden. Longklepconformatie werd bevestigd door μCT. In dit geval waren de bijsluiters coapt (gesloten) en was de annulus circulair (figuur 2A). Figuur 2B,C</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Hier beschrijven we een correlatieve workflow voor de excisie, druk, fixatie en beeldvorming van de muriene longklep om de bruto-conformatie en lokale extracellulaire matrixstructuren te bepalen.

Chirurgie en monsterverwerking voor correlatieve beeldvorming van de muriene longklep

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Dit protocol is belangrijk omdat het is ontworpen om vragen te beantwoorden over de structuurfunctie correleren van de muriene longklep, die over het algemeen lastig is vanwege de inherente heterogeniteit. De gecontroleerde fixatie en correlatieve beeldvorming werden gebruikt om de structuur op meerdere lengteschalen vast te leggen. Lokale beelden met hoge resolutie kunnen vervolgens worden teruggeplaatst naar de precieze anatomische locatie op de longklep.De demonstranten van de procedure zijn Dr.Tai Yi, de directeur van microchirurgie in het Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde van het Nationwide Children's Hospital. Begin met het autoclaaf van de gereedschappen die nodig zijn voor de dissectie van de muis, waaronder fijne scharen, microforceps, microvasculaire klemmen, klemaanbrengende tangen, microneedlehouders, veerscharen en oprolmechanismen. Na het euthanaseren van een volwassen C57BL/6-muis, plaatst u deze in een dorsale ligfietspositie op een dienblad, zet u de ledematen vast met tape en voert u de thoracotomie uit.Stel het hart bloot door overtollig vetweefsel en fascia te verwijderen, verwijder vervolgens het rechter atrium en doordrenk de linkerventrikel met zoutoplossing op kamertemperatuur. Verwijder het hele hart door de superieure vena cava, inferieure vena cava, longslagader en aorta te doorsnijden en snijd ongeveer twee millimeter boven de ventriculoatriale verbinding, die zal dienen als de buis voor druk. Verwijder de linker- en rechterventrikels om de kamers bloot te stellen aan atmosferische druk, zodat de longstamstructuur niet wordt beïnvloed door het verwijderen van de ventrikels.Anastomose drukslang met de longslagader, waardoor ongeveer een millimeter afstand tussen de sinotubulaire verbinding en het einde van de slang overblijft om grote bewegingen van de folders en de longstam mogelijk te maken. Verhef het reservoir tot een analoge fysiologische druk en vul het met de zoutoplossing. Test het doorstroomsysteem om er zeker van te zijn dat er geen verstoppingen of luchtbellen zijn.Bevestig een kraan aan de anastomosed longklep en zorg voor voldoende doorstroming door de slang door het uitstroomkanaal te schakelen. Zodra de stroom voldoende is, schakelt u de uitstroom naar de anastomosed longklep en zorgt u voor druk van de longstam die wordt geïdentificeerd door stamopgezette stand. Na bevestiging van de druk van de longstam, geleidelijk primaire fixatieve oplossing opnemen totdat 25% van de reservoircapaciteit van de zoutoplossing is gezuiverd.Plaats een fixatief gedrenkt gaas over het weefselmonster om uitdroging te voorkomen. Doordrenkt het fixatief gedurende drie uur en vul het reservoir om een constante druk te behouden. Bewaar na perfusie de hartklep in de fixatieve oplossing bij vier graden Celsius tot gebruik gedurende maximaal een week.Voor het kleuren, was het vaste hartklepmonster drie keer met koude 0,15 molaire cacodylaatbuffer gedurende vijf minuten en dompel de hartklep volledig onder in een oplossing van 1,5 kaliumferrocyanide, 0,15 molair cacodylaat, twee millimolylcalciumchloride en 2% osmiumtetroxide op ijs gedurende een uur. Was de monsters met dubbel gedestilleerd water op kamertemperatuur door ze vijf minuten in een buis te plaatsen met lichte agitatie. Na nog drie wasbeurten plaatst u het monster in gefilterde thiocarbohydrazideoplossing op kamertemperatuur.Was het monster na 20 minuten driemaal met water, zoals eerder is aangetoond. Plaats vervolgens het monster in 2% osmiumtetroxide bij kamertemperatuur. Was het na 30 minuten drie keer gedurende vijf minuten met water en incubeer het monster 's nachts in 1% uranylacetaat bij vier graden Celsius.Bereid ondertussen een oplossing van loodnitraat voor. Voer de volgende dag de wasstap drie keer uit zoals eerder is aangetoond en incubeer vervolgens het hartklepweefsel in lood aspartaatoplossing bij 60 graden Celsius gedurende 30 minuten. Was de monsters nog drie keer en voer vervolgens een seriële uitdrogingsbehandeling uit op de hartklepweefsels met vers bereide 20, 50, 70 en 90% ethanol op ijs gedurende elk vijf minuten, gevolgd door twee daaropvolgende behandelingen met 100% ethanol.Na uitdroging verplaatst u de weefsels naar ijskoud aceton en plaatst u het vervolgens gedurende 10 minuten in verse aceton op kamertemperatuur. Maak voor inbedding het harsmengsel volgens de specificaties van de fabrikant. Plaats weefsels in volgende behandelingen van 25 tot 75, 50 tot 50 en 75 tot 25 hars tot acetonmengsel gedurende elk twee uur.Plaats ten slotte de weefsels 's nachts in 100% hars. Leg de volgende dag weefsels in verse 100% hars. Breng na twee uur de weefsels over naar een inbeddingscapsule, voeg verse 100% hars toe en plaats het gedurende 48 uur in een oven van 60 graden Celsius om uit te harden.De verwijderde anastomosed longslagader voor en na de toepassing van hydrostatische druk wordt hier getoond. De longstam distends radiaal aan te geven dat de longklep folders zijn in een gesloten configuratie. Microgecomputeerde tomografie bevestigde de bevestiging van de longklep.De bijsluiters werden gesloten en de annulus was rond, terwijl verschillende gradaties van ontoereikende longklepdruk door fixatie of arteriële instorting werden waargenomen. Het micro CT-volume dat virtuele doorsneden weer geeft, was gecorreleerd met optische beelden om de snijrichting en locatie te bevestigen. SBF SEM-beelden met hoge resolutie werden genomen in een lokale regio in een bijsluiter wanneer het specimenblok zich op de gewenste locatie en oriëntatie bevond.Gecorreleerde afbeeldingen tussen de micro CT-volumeweergave virtuele slice, lage resolutie en hoge resolutie SBF SEM-afbeeldingen worden hier weergegeven. In 3D-weergave van een gesegmenteerd gebied van de longklep kunnen extracellulaire componenten zoals endotheelcellen, valvulaire interstitiële cellen en extracellulaire vezels worden geïdentificeerd. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het uitvoeren van de druk kritiek is en ervoor zorgt dat de opbrengst zo hoog mogelijk is.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Solid-state entcopolymeer Elektrolyten voor Lithium Battery Toepassingen

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Ruimtelijke scheiding van moleculaire conformers en clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Snelle beeldvormende techniek om te studeren Drop Impact Dynamiek van niet-Newtoniaanse vloeistoffen

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Electron Channeling Contrast Imaging voor Rapid III-V hetero karakterisatie

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Gebruik van een Multi-compartiment Dynamic enkel enzym Phantom voor Studies van gehyperpolariseerd Magnetic Resonance Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Wicking Tests voor Unidirectionele Stoffen: Metingen van capillaire Parameters om capillaire druk in Liquid Composite Molding Processen Evalueer

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Verwerking van Bulk Nanocrystalline metalen bij de US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Richtsnoeren en ervaring met behulp van Imaging Biomarker Explorer (IBEX) voor Radiomics

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Gesmolten gloeidraad fabricage (FFF) van metaal-keramische onderdelen

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Fabricage van Nanoheight Channels waarin Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate voor Akoestische Nanofluidics

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...