Name: surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve
Uploaded: 2021-08-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Ce travail est soutenu, en partie, par les subventions R01HL139796 et R01HL128847 à CKB et RO1DE028297 et CBET1608058 pour DWM.

L’utilisation d’animaux dans cette étude était conforme au comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement du Nationwide Children’s Hospital en vertu du protocole AR13-00030.
1. Excision valvulaire pulmonaire
<ol><li>Autoclavez les outils nécessaires à la dissection de la souris. Cela comprend les ciseaux fins, les micro-pinces, les pinces micro vasculaires, les pinces d’application de pince, les porte-micro-aiguilles, les ciseaux à ressort et les rétracteurs....

<ol>
	<li>Azari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+cost-effectiveness+of+heart+valve+replacement+with+a+mechanical+versus+biological+prosthesis+in+patients+with+heart+valvular+disease.">A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease.</a> Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).</li><li>Ng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-dependent+pathogenesis+of+mitral+valve+prolapse+in+a+mouse+model+of+Marfan+syndrome.">TGF-&#946;-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).</li><li>Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activation+of+valvulogenic,+chondrogenic,+and+osteogenic+pathways+in+mouse+models+of+myxomatous+and+calcific+aortic+valve+disease.">Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).</li><li>Jim&#233;nez-Altay&#243;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stenosis+coexists+with+compromised+&#945;1-adrenergic+contractions+in+the+ascending+aorta+of+a+mouse+model+of+Williams-Beuren+syndrome.">Stenosis coexists with compromised &#945;1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome.</a> Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).</li><li>Thacoor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+prolapse+and+Marfan+syndrome.">Mitral valve prolapse and Marfan syndrome.</a> Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).</li><li>McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Assessment+of+the+Pig,+Mouse+and+Human+Genomes.">A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes.</a> The Minipig in Biomedical Research. , (2011).</li><li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease.">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).</li><li>Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+biomechanics+of+heart+valve+function.">On the biomechanics of heart valve function.</a> Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).</li><li>Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+function:+a+biomechanical+perspective.">Heart valve function: a biomechanical perspective.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).</li><li>Morales, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-CT+scouting+for+transmission+electron+microscopy+of+human+tissue+specimens.">Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens.</a> Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).</li><li>Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aortic+valve+microstructure:+Effects+of+transvalvular+pressure.">The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).</li><li>Ayoub, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+biomechanics+and+underlying+mechanobiology.">Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology.</a> Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).</li><li>Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+biaxial+mechanical+behavior+of+the+aortic+heart+valve+leaflet.">Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet.</a> Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).</li><li>Korn, E. D., Weisman, R. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=loss+of+lipids+during+preparation+of+amoebae+for+electron+microscopy.">loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Hinton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+heart+valve+structure+and+function:+Echocardiographic+and+morphometric+analyses+from+the+fetus+through+the+aged+adult.">Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).</li><li>Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColVa1+and+ColXIa1+are+required+for+myocardial+morphogenesis+and+heart+valve+development.">ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development.</a> Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).</li><li>Hamatani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+investigation+of+congenital+bicuspid+aortic+valve+stenosis,+compared+with+atherosclerotic+tricuspid+aortic+valve+stenosis+and+congenital+bicuspid+aortic+valve+regurgitation.">Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation.</a> PLoS One. 11 (8), (2016).</li></ol>

L’enlèvement des ventricules sert à deux fins. Premièrement, exposer le côté ventricule à la pression atmosphérique, n’ayant donc besoin que d’appliquer une pression transvalvulaire du côté artériel de la valve pulmonaire pour se fermer, et deuxièmement, fournir une base stable pour empêcher la torsion du tronc pulmonaire. Pendant la pressurisation, le tronc pulmonaire se distendait radialement et inférieurement, ce qui le rend sujet à la torsion, provoquant l’effondrement du tronc pulmonaire. Le pr...

La valve pulmonaire (PV) sert à assurer le flux sanguin unidirectionnel entre le ventricule droit et l’artère pulmonaire. Les malformations valvulaires pulmonaires sont associées à plusieurs formes de cardiopathie congénitale. Le traitement actuel de la cardiopathie congénitale (HVD) est la réparation valvulaire ou le remplacement valvulaire, qui peut nécessiter de multiples chirurgies invasives tout au long de la vie d’un patient1. Il a été largement admis que la fonction de la valve cardiaque est dérivée de sa structure, souvent appelée corrélat structure-fonction. Plus précisément, les propriétés géométriques et biomécaniques du cœur dictent sa fonction. Les propriétés mécaniques, à leur tour, sont déterminées par la composition et l’organisation de l’ECM. En développant une méthode pour déterminer les propriétés biomécaniques des valves cardiaques murines, des modèles animaux transgéniques peuvent être utilisés pour interroger le rôle de l’ECM sur la fonction et le dysfonctionnement des valvescardiaques 2,3,4,5.
Le modèle animal murin a longtemps été considéré comme la norme pour les études moléculaires parce que les modèles transgéniques sont plus facilement disponibles chez la souris que chez d’autres espèces. Les modèles transgéniques murins fournissent une plate-forme polyvalente pour la recherche sur les maladies liées aux valves cardiaques6. Cependant, l’expertise chirurgicale et les exigences en matière d’instrumentation pour caractériser à la fois la géométrie et l’organisation ecm ont été un obstacle majeur à l’avancement de la recherche HVD. Les données hstologiques dans la littérature fournissent une image du contenu de la matrice extracellulaire de la valve cardiaque murine, mais uniquement sous la forme d’images 2D, et sont incapables de décrire son architecture 3D7,8. De plus, la valve cardiaque est à la fois spatialement et temporellement hétérogène, ce qui rend difficile de tirer des conclusions entre les expériences concernant l’organisation de l’ECM si l’échantillonnage et la conformation ne sont pas fixés. Les méthodes conventionnelles de caractérisation 3D, telles que l’IRM ou l’échocardiographie 3D, ne fournissent pas la résolution nécessaire pour résoudre les composants ECM9,10.
Ce travail détaille un flux de travail entièrement corrélatif où l’hétérogénéité temporelle due au cycle cardiaque a été abordée en fixant la conformation du PV murin avec la pression transvalvulaire hydrostatique. L’hétérogénéité spatiale a été contrôlée avec précision en échantillonnant les régions d’intérêt et en enregistrant des ensembles de données provenant de différentes modalités d’imagerie, en particulier la microscopie électronique à balayage μCT et à balayage de bloc série, sur différentes échelles de longueur. Cette méthode de repérage avec μCT pour guider l’échantillonnage en aval a été proposée précédemment, mais comme la valve pulmonaire présente une variation temporelle, un niveau de contrôle supplémentaire était nécessaire au niveau chirurgical11.
Les études in vivo décrivant la biomécanique des valves cardiaques murines sont rares et, au lieu de cela, s’appuient sur des modèles informatiques pour décrire le comportement de déformation. Il est d’une importance cruciale que les données extracellulaires locales sur l’échelle nanométrique soient liées à la géométrie et à l’emplacement de la valve cardiaque. Ceci, à son tour, fournit des distributions quantifiables et cartographiées spatialement des protéines ECM contribuant mécaniquement, qui peuvent être utilisées pour renforcer les modèles de valves cardiaques biomécaniques existants12,13,14.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>25% glutaraldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16210</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodium chloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-4888-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof ethanol</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19150</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (aq)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>157-4-100</td>
			<td>Primary fixative component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbable hemostat</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 10-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>TI38402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black polyamide monofilament suture, 6-0</td>
			<td>AROSurgical instruments Corporation</td>
			<td>SN-1956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td>Approximately 1 yo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applying forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tip applicators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 fine forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan ACM resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>14040</td>
			<td>For embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heliscan microCT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Micro-CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56-84-8</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>17900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-vacuum backscatter detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VSDBS</td>
			<td>SEM backscatter detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-adson forcep</td>
			<td>FST</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SLGP033NS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven songes</td>
			<td>McKesson Corp.</td>
			<td>94442000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14459-95-1</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1310-58-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure monitor line</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc.</td>
			<td>MX562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Hospira Inc.</td>
			<td>NDC 0409-0138-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 3 BEEM capsule</td>
			<td>EMS</td>
			<td>69910-01</td>
			<td>Embedding container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6131-99-3</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solibri retractors</td>
			<td>FST</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter, carbon and e-beam coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE600</td>
			<td>Gold coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>21900</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tish needle holder/forcep</td>
			<td>Micrins</td>
			<td>MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td>Staining component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumescope scanning electron microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VOLUMESCOPESEM</td>
			<td>Serial Block Face Scanning Electron Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine sterile solution</td>
			<td>Akorn Inc.</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgery and sample processing for correlative imaging of the murine pulmonary valve

Les causes sous-jacentes de la maladie liée aux valves cardiaques (HVD) sont insaisissables. Les modèles animaux murins fournissent un excellent outil pour étudier le HVD, mais l’expertise chirurgicale et instrumentale requise pour quantifier avec précision la structure et l’organisation sur plusieurs échelles de longueur a retardé son avancement. Ce travail fournit une description détaillée de la dissection murine, de la coloration en bloc, du traitement des échantillons et des procédures d’imagerie corrélative pour représenter la valve cardiaque à différentes échelles de longueur. La pression transvalvulaire hydrostatique a été utilisée pour contrôler l’hétérogénéité temporelle en fixant chimiquement la conformation de la valve cardiaque. La micro-tomodensitométrie (μCT) a été utilisée pour confirmer la géométrie de la valve cardiaque et fournir une référence pour le traitement des échantillons en aval nécessaire à la microscopie électronique à balayage de face de bloc série (SBF-SEM). Des images SEM en série haute résolution de la matrice extracellulaire (ECM) ont été prises et reconstruites pour fournir une représentation 3D locale de son organisation. Les méthodes d’imagerie μCT et SBF-SEM ont ensuite été corrélées pour surmonter la variation spatiale à travers la valve pulmonaire. Bien que les travaux présentés soient exclusivement sur la valve pulmonaire, cette méthodologie pourrait être adoptée pour décrire l’organisation hiérarchique dans les systèmes biologiques et est essentielle pour la caractérisation structurelle sur plusieurs échelles de longueur.

L’anastomose de l’artère pulmonaire au tube de pressurisation est illustrée à la figure 1A. Après l’application de la pression hydrostatique, le tronc pulmonaire se distend radialement(Figure 1B)indiquant que les feuillets de la valve pulmonaire sont dans une configuration fermée. La conformation valvulaire pulmonaire a été confirmée par μCT. Dans ce cas, les folioles étaient coapt (fermées) et l’anneau était circulaire (...

Watch this Scientific Journal Video about Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve at JoVE.com

Surgery and Sample Processing for Correlative Imaging of the Murine Pulmonary Valve

Ici, nous décrivons un flux de travail corrélatif pour l’excision, la pressurisation, la fixation et l’imagerie de la valve pulmonaire murine afin de déterminer la conformation grossière et les structures de la matrice extracellulaire locale.

Chirurgie et traitement des échantillons pour l’imagerie corrélative de la valve pulmonaire murine

The underlying causes of heart valve related-disease (HVD) are elusive. Murine animal models provide an excellent tool for studying HVD, however, the ...

Ce protocole est important car il est conçu pour répondre à des questions sur le corrélat de la fonction de structure de la valve pulmonaire murine, ce qui est généralement délicat en raison de son hétérogénéité inhérente. La fixation contrôlée et l’imagerie corrélative ont été utilisées pour capturer la structure sur plusieurs échelles de longueur. Les images locales à haute résolution peuvent ensuite être mappées à l’emplacement anatomique précis de la valve pulmonaire.Le Dr Tai Yi, directeur de la microchirurgie au Centre de médecine régénérative de l’hôpital national pour enfants, fera la démonstration de la procédure. Commencez par autoclaver les outils nécessaires à la dissection de la souris, y compris les ciseaux fins, les microforceps, les pinces microvasculaires, les pinces d’application de pince, les porte-micro-aiguilles, les ciseaux à ressort et les rétracteurs. Après avoir euthanasié une souris adulte C57BL/6, placez-la en position couchée dorsale sur un plateau, fixez ses membres avec du ruban adhésif et effectuez la thoracotomie.Exposez le cœur en enlevant tout excès de tissu adipeux et de fascia, puis retirez l’oreillette droite et perfuser le ventricule gauche avec une solution saline à température ambiante. Enlevez tout le cœur en coupant la veine cave supérieure, la veine cave inférieure, l’artère pulmonaire et l’aorte, et coupez environ deux millimètres au-dessus de la jonction ventriculo-auriculaire, qui servira de conduit pour la pressurisation. Retirez les ventricules gauche et droit pour exposer les chambres à la pression atmosphérique, en veillant à ce que la structure du tronc pulmonaire ne soit pas affectée par l’élimination des ventricules.Tube de pressurisation anastomose avec l’artère pulmonaire, laissant environ un millimètre de distance entre la jonction sinotubulaire et l’extrémité du tube pour s’adapter aux grands mouvements des folioles et du tronc pulmonaire. Élever le réservoir à une pression physiologique analogue et le remplir avec la solution saline. Testez le système d’écoulement pour vous assurer qu’il n’y a pas de blocages ou de bulles d’air.Fixez un robinet d’arrêt à la valve pulmonaire anastomosée et assurez-vous d’un débit adéquat à travers le tube en changeant le tractus d’écoulement. Une fois que le débit est suffisant, basculer le débit sortant vers la valve pulmonaire anastomosée et assurer la pressurisation du tronc pulmonaire identifié par distension du tronc. Après avoir confirmé la pressurisation du tronc pulmonaire, incorporer progressivement la solution fixatrice primaire jusqu’à ce que 25% de la capacité du réservoir de la solution saline soit purgée.Placez une gaze imbibée de fixateur sur l’échantillon de tissu pour éviter le dessèchement. Perfuser le fixateur pendant trois heures, en remplissant le réservoir pour maintenir une pression constante. Après la perfusion, conservez la valve cardiaque dans la solution fixatrice à quatre degrés Celsius jusqu’à une utilisation pouvant aller jusqu’à une semaine.Pour la coloration, laver l’échantillon de valve cardiaque fixe trois fois avec un tampon de cacodylate molaire froid de 0,15 pendant cinq minutes et immerger complètement la valve cardiaque dans une solution de ferrocyanure de potassium 1,5, de cacodylate molaire 0,15, de chlorure de calcium millimolaire et de tétroxyde d’osmium à 2% sur la glace pendant une heure. Lavez les échantillons avec de l’eau distillée double à température ambiante en les plaçant dans un tube pendant cinq minutes avec une légère agitation. Après trois autres lavages, placer l’échantillon dans une solution de thiocarbohydrazide filtrée à température ambiante.Après 20 minutes, lavez l’échantillon trois fois avec de l’eau, comme démontré précédemment. Ensuite, placez l’échantillon dans du tétroxyde d’osmium à 2% à température ambiante. Après 30 minutes, lavez-le avec de l’eau trois fois pendant cinq minutes chacun et incubez l’échantillon dans de l’acétate d’uranyle à 1% pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Pendant ce temps, préparez une solution de nitrate de plomb. Le lendemain, effectuez l’étape de lavage trois fois comme démontré précédemment, puis incubez le tissu valvulaire cardiaque dans une solution d’aspartate de plomb à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lavez les échantillons trois fois de plus, puis effectuez un traitement de déshydratation en série sur les tissus valvulaires cardiaques avec de l’éthanol 20, 50, 70 et 90% fraîchement préparé sur de la glace pendant cinq minutes chacun, suivi de deux traitements ultérieurs avec de l’éthanol à 100%.Après la déshydratation, déplacez les tissus vers de l’acétone glacée, puis placez-la dans de l’acétone fraîche à température ambiante pendant 10 minutes. Pour l’intégration, faites le mélange de résine selon les spécifications du fabricant. Placer les tissus dans des traitements ultérieurs de 25 à 75, 50 à 50 et 75 à 25 résine à acétone mélange pendant deux heures chacun.Enfin, placez les tissus dans 100% de résine pendant la nuit. Le lendemain, placez les tissus dans de la résine fraîche à 100%. Après deux heures, transférer les tissus dans une capsule d’incorporation, ajouter de la résine fraîche à 100% et la placer dans un four à 60 degrés Celsius pendant 48 heures pour durcir.L’artère pulmonaire anastomosée excisée avant et après l’application de la pression hydrostatique est montrée ici. Le tronc pulmonaire se distend que les feuillets valvulaires pulmonaires sont dans une configuration fermée. La tomographie microcalculée a confirmé la confirmation de la valve pulmonaire.Les folioles étaient fermées et l’anneau était circulaire tandis que divers degrés de pressurisation inadéquate de la valve pulmonaire par fixation ou effondrement artériel ont été observés. Le volume micro CT rendant des sections transversales virtuelles a été corrélé avec des images optiques pour confirmer la direction et l’emplacement du découpage. Des images SBF SEM à haute résolution ont été prises dans une région locale d’une notice lorsque le bloc d’échantillons se trouvait à l’emplacement et à l’orientation souhaités.Les images corrélées entre le volume micro CT rendant la tranche virtuelle, les images SEM SBF basse résolution et haute résolution sont présentées ici. Dans la représentation 3D d’une région segmentée de la valve pulmonaire, des composants extracellulaires tels que les cellules endothéliales, les cellules interstitielles valvulaires et les fibres extracellulaires peuvent être identifiés. Lorsque vous essayez ce protocole, veuillez garder à l’esprit que la pressurisation est essentielle et garantira que le rendement soit aussi élevé que possible.

Research

JoVE Journal

Engineering

Solid-state Graft Copolymer Electrolytes for Lithium Battery Applications

Solid-state greffe électrolytes de copolymère pour le lithium applications de batteries

Battery safety has been a very important research area over the past decade. Commercially available lithium ion batteries employ low flash point (&lt;80 ...

Recherche

Ingénierie

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Séparation spatiale des conformateurs moléculaires et des amas

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Fast Imaging Technique to Study Drop Impact Dynamics of Non-Newtonian Fluids

Imagerie rapide technique permettant d&#39;étudier l&#39;impact de baisse de la dynamique des fluides non-newtoniens

In the field of fluid mechanics, many dynamical processes not only occur over a very short time interval but also require high spatial resolution for ...

Electron Channeling Contrast Imaging for Rapid III-V Heteroepitaxial Characterization

Electron Canalisation imagerie de contraste pour Rapid III-V hétéroépitaxiale Caractérisation

Misfit dislocations in heteroepitaxial layers of GaP grown on Si(001) substrates are characterized through use of electron channeling contrast imaging ...

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Utilisation d&#39;un multi-compartiment dynamique unique Enzyme Phantom pour les études de hyperpolarisé Agents de résonance magnétique

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Wicking Tests for Unidirectional Fabrics: Measurements of Capillary Parameters to Evaluate Capillary Pressure in Liquid Composite Molding Processes

Wicking Tests pour unidirectionnels Tissus: Mesures de Capillaire paramètres pour évaluer la pression capillaire dans les processus Liquid Composite Molding

During impregnation of a fibrous reinforcement in liquid composite molding (LCM) processes, capillary effects have to be understood in order to identify ...

Processing of Bulk Nanocrystalline Metals at the US Army Research Laboratory

Traitement des métaux nanocristallins en vrac à l’US Army Research Laboratory

Given their potential for significant property improvements relative to their large grained counterparts, much work has been devoted to the continued ...

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer (IBEX) for Radiomics

Guidelines and Experience Using Imaging Biomarker Explorer IBEX for Radiomics

Lignes directrices et l’expérience à l’aide d’imagerie biomarqueur Explorer (IBEX) pour Radiomics

Imaging Biomarker Explorer (IBEX) is an open-source tool for medical imaging radiomics work. The purpose of this paper is to describe how to use IBEX's ...

Fused Filament Fabrication (FFF) of Metal-Ceramic Components

Fused Filament Fabrication FFF of Metal-Ceramic Components

Fabrication de Filament fondu (FFF) des composants en métal-céramique

Technical ceramics are widely used for industrial and research applications, as well as for consumer goods. Today, the demand for complex geometries with ...

Fabrication of Nanoheight Channels Incorporating Surface Acoustic Wave Actuation via Lithium Niobate for Acoustic Nanofluidics

Fabrication de canaux nanométriques incorporant l'actuation des ondes acoustiques de surface via le niobate de lithium pour la nanofluidique acoustique

Controlled nanoscale manipulation of fluids is known to be exceptionally difficult due to the dominance of surface and viscous forces. Megahertz-order ...